Białko zapalne makrofagów 1 jako sygnał kostymulacyjny dla reakcji natychmiastowej nadwrażliwości z udziałem komórek tucznych ad 9

ELISA w surowicy IgE, IgG1 lub IgG2a przeprowadzono stosując zestaw myszy Mys Opt EIA lub skoniugowane z biotyną przeciwciała przeciw-mysie IgG1 lub IgG2a (BD Biosciences. Pharmingen). Test ELISA specyficzny dla antygenu przeprowadzono przy użyciu płytek pokrytych Fel d1 zamiast przeciwciał wychwytujących. Immunohistochemia. Serie zamrożonych skrawków (o grubości 10 urn) utrwalono acetonem w temperaturze 20 ° C przez 10 minut i wybarwiono na CCR1 stosując poliklonalne przeciwciało anty-CCR1 (Santa Cruz Biotechnology Inc.) i zestaw VECTASTAIN ABC (Vector Laboratories Inc.). Sygnały pozytywne były wizualizowane przez podłoże AEC. Test ochrony przed RNazą. Tkanka oczna została uzyskana od 4. 5 zwierząt w każdej grupie i przygotowana do ekstrakcji RNA. Homogenizowaliśmy tkankę za pomocą młynka do tkanek i ekstrahowaliśmy całkowity RNA przez homogenizację w RNA STAT-60 (Tel-Test Inc.) zgodnie z instrukcjami producenta i analizowano 20 .g RNA. Test ochrony przed RNazą przeprowadzono z użyciem sond mysiej eotaksyny-1, MIP-1 a, L32, GAPDH, mCK-5 i płytek mCK-1 (BD Biosciences. Pharmingen). Zabezpieczony, hybrydyzowany RNA poddano elektroforezie na 4,5% denaturowanego żelu PAGE. Hybrydyzacja in situ z antysensownym MIP-1. Sondy RNA. Aby analizować ekspresję spojówki MIP-1. sygnału, przeprowadziliśmy hybrydyzację in situ MIP-1. jak wcześniej opisano (35, 18), używając zamrożonych skrawków. Krótko mówiąc, pełnej długości cDNA mysiego MIP-1. w pBluescript SK + zostały zlinearyzowane, a sondy antysensownego i sensownego RNA zostały wygenerowane przy użyciu odpowiednio polimerazy RNA T7 i T3 (Promega Corp.). Znakowane izotopem 35S sondy zredukowano do 200. 300 rybonukleotydów za pomocą alkalicznej hydrolizy. Po hybrydyzacji, szkiełka przemywano w 65 ° C i autoradiografowano przez 4 dni do 5 tygodni w 4 ° C. Następnie barwiono je kontrastowo za pomocą barwienia H & E lub Giemsy. Ustaliliśmy specyficzność hybrydyzacji za pomocą sondy sensownej. Badanie biernej sensybilizacji in vitro przy użyciu wyizolowanej tkanki spojówki. Tkanka tkanki spojówkowej była zbierana chirurgicznie pod mikroskopem operacyjnym od myszy naiwnych i uczulana przez inkubację z IgE przeciw AI 2,4-dinitrofenolem (LHP) (IgE przeciw ALP-DNH) (50 ng / ml; Sigma-Aldrich) w HBSS przez 1,5 godziny w 37 ° C. Po 3-krotnym przemyciu tkanka spojówkowa została poddana prowokacji in vitro HSA-DNP; mg / ml) w 37 ° C. Supernatanty zebrano 30 minut po prowokacji i testowano na obecność histaminy ELISA (IBL Immuno-Biological Laboratories). Dla MIP-1. lub suplementacja eotaksyna-1, dodano je do pożywki 15 minut po prowokacji. Próbki spojówki przetwarzano tak, aby można było zidentyfikować komórki tuczne za pomocą barwienia metachromatycznego. Barwienie błękitem toluidynowym wykazało tę samą liczbę komórek tucznych i degranulację w spojówce, co miało barwnik Giemsy. Udowodniono, że degranulacja komórek tucznych po prowokacji in vitro koreluje z uwalnianiem histaminy przez analizę morfologiczną po osadzeniu próbek w JB-4. Wstrzyknięcie podspojówkowe MIP-1 .. Pięć mikrolitrów rekombinowanego mysiego MIP-1. (10 ng / ml w 0,1% BSA / PBS) wstrzyknięto myszom naiwnie podskórnie za pomocą igły 30G przymocowanej do strzykawki Hamiltona. Poziomy LPS określone metodą limizyjnego lizatu amoebocytów wynosiły mniej niż 0,1 ng / mg. We wskazanym punkcie czasowym po wstrzyknięciu, zostały one uśmiercone, a próbki spojówkowe przygotowano do analizy morfologicznej. Pasywna sensytyzacja komórek RBL-2H3 transfekowanych CCR1. Komórki RBL-2H3 eksprymujące ludzką CCR1 (19) uczulano anty-DNP IgE (100 ng / ml) i poddano prowokacji HSA-DNP (10 ng / ml) in vitro. Dla MIP-1. suplementacja, różne stężenia rekombinowanego ludzkiego MIP-1. zostały dodane do nośnika 5 minut po prowokacji. Supernatanty zebrano 20 minut po dodaniu MIP-1. i testowano pod względem. -heksoaminidazy ELISA. A-heksoaminidazę w supernatantach i lizacie komórkowym oznaczono ilościowo przez hydrolizę p-nitrofenylo-N-acetylo-a-D-glukopiranozydu (Sigma-Aldrich) w 0,1 M buforze cytrynianowo-sodowym (pH 4,5) przez 60 minut w 37 ° C. . Procent uwalniania a-heksoaminidazy obliczono jak opisano wcześniej (21). Pomiar wysięku plazmowego. Wysięk osocza wywołany natychmiastową nadwrażliwością oceniano metodą wynaczynienia błękitem Evansa (EB) (21). W tym celu niezestranizowane myszy poddano wstrzyknięciu do żyły ogonowej 1% EB w PBS (6,7. L / g masy ciała) i poddano prowokacji alergenem. Myszy uśmiercono 90 minut po ekspozycji na alergen, i zebrano powieki i tkanki spojówki. Zważone tkanki ekstrahowano dla EB w 500 .l formamidu przez 24 godziny. Wynaczynione stężenie EB określono przez spektrofotometrię przy 620 nm w oparciu o standardową krzywą EB w formamidzie. Analiza statystyczna Dane są podsumowane jako średnie. SEM. Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą niesparowanego testu Studenta (dwukierunkowy), testu U Manna-Whitneya lub ANOVA, w zależności od potrzeb. Podziękowania Dziękujemy firmie Barbara Sherry za dostarczenie przeciwciał przeciwko MIP-1. we wczesnych eksperymentach pilotażowych. Przedstawione tutaj dane wykorzystują komercyjne przeciwciało, aby uzyskać jednoznaczną specyficzność wobec MIP-1 .. Dziękujemy również wszystkim członkom laboratorium Ono za ich wkład w trakcie tych eksperymentów. Bardzo doceniamy również konstruktywną krytykę Redakcji JCI, recenzentów tego manuskryptu oraz osób odpowiedzialnych za redagowanie zaakceptowanego manuskryptu. Przypisy Niestandardowe stosowane skróty: DNP, 2,4-dinitrofenol; Fel d1, Felis domesticus allergen 1; MCP-3, białko chemotaktyczne monocytów a3; MIP-1 (3, białko zapalne makrofagów. .. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.
[więcej w: street workout plan treningowy, typy osobowości wg junga, tobrosopt dex ]
[hasła pokrewne: koszulki ratownictwo medyczne, tobrosopt dex, koprolalia ]
[patrz też: koszulki ratownictwo medyczne, tobrosopt dex, koprolalia ]