Hamowanie autofagii zwiększa apoptozę indukowaną terapią w modelu chłoniaka indukowanym przez Myc ad 10

Komórki następnie zamrożono w porcjach do przyszłych eksperymentów. Wszystkie eksperymenty in vitro przeprowadzono w kompletnej pożywce zawierającej pożywkę RPMI 1640 (Invitrogen) uzupełnioną 10% dezaktywowaną termicznie FBS (Gemini Bio-Products), 10 U / ml penicyliny / streptomycyny i 2 mM l-glutaminy (Invitrogen). Ponadto, dodano codziennie 10 .g / ml lipopolisacharydu (Sigma-Aldrich) i 0,2 ng / ml IL-7 (R & D Systems). Dla wszystkich eksperymentów in vitro, media plus suplementy i leki były codziennie zmieniane. Liczbę komórek oceniano za pomocą analizatora cząstek Coulter Z2 lub wykluczenia błękitem trypanu. W przypadku testów MTS, 2 x 105 komórek / studzienkę wysiano na 96-studzienkowych płytkach w pożywce RPMI zawierającej IL-7, LPS i wskazane leczenie lekowe. Po 24 godzinach dodano odczynnik MTS dostarczony w Cell Aiter 96 AQueous Assay (Promega) i wyniki analizowano zgodnie z zaleceniami producenta. Linie komórkowe MEF p53 + / +, p53a / a, p53 + / + GFP-LC3 i p53 p / pGFP-LC3 zostały pasażowane w podłożu DMEM uzupełnionym 10% dezaktywowanym termicznie FBS (Gemini Bio-Products), 10 U / ml penicyliny / streptomycyny i 2 mM l-glutaminy (Invitrogen). Immunoblot. Hodowane komórki poddano lizie w buforze RIPA. Lizaty nowotworowe otrzymano przez ręczne wstrząsanie tkanką guza i lizę w RIPA. Lizaty standaryzowano pod kątem zawartości białka i rozdzielono metodą SDS-PAGE na 14% żelu NuPAGE (Invitrogen). Nitrocelulozowe bloty sondowano przeciwciałami przeciwko pociętej kaspazy-3 (królicze przeciwciało monoklonalne, 1: 000, technologia sygnalizacji komórkowej); anty-aktyna (mysie przeciwciało monoklonalne, 1: 10 000, Sigma-Aldrich); i anty-ATG5 (królicze przeciwciało poliklonalne, 1: 2000, dar od N. Mizushima, Tokyo Medical and Dental University, Tokio, Japonia). Ocena ilościowa mikroskopii elektronowej autofagosomów i apoptozy. Tkanki uzyskane z nowotworów natychmiast utrwalono za pomocą 2,5% aldehydu glutarowego / 2% formaldehydu za pomocą 0,1 M kakodylanu sodu i przechowywano w 4 ° C aż do zatopienia. Komórki zostały utrwalone 2% tetratlenkiem osmu; po tym nastąpił wzrost stopnia dehydratacji gradientowej przy użyciu etanolu i tlenku propylenu. Komórki następnie zatopiono w pożywce LX-112 (Ladd), a wycinki wycięto ultracienką (90 nm), umieszczono na niepowlekanych siatkach miedzi i zabarwiono 0,2% cytrynianem ołowiu i 1% octanem uranu. Obrazy badano za pomocą elektronowego mikroskopu elektronowego JEOL-1010 (JEOL) przy 80 kV. Do kwantyfikacji żywotnych komórek za pomocą mikroskopii elektronowej tkanki nowotworowej uzyskano mikrografy o dużej mocy (x 12.000. 20 000) z 25 pojedynczych komórek z wielu różnych słabo zasilanych pól w każdym guzie. Komórki uznano za nieapoptotyczne, jeśli utrzymano integralność błony jądrowej i cytoplazmatycznej. W celu ilościowego oznaczenia komórek apoptotycznych komórki z cytoplazmatycznym i jądrowym pęcherzykiem oraz skondensowaną chromatyną lub ciałami apoptotycznymi oceniono jako apoptotyczne. W celu ilościowego oznaczenia pęcherzyków autofagicznych na żywą komórkę oceniano liczbę pęcherzyków podwójnej błony na komórkę nieapoptotyczną. Dane są przedstawione jako średnie. SD. Barwienie metodą TUNEL i obrazowanie fluorescencyjne. Barwienie TUNEL przeprowadzono za pomocą zestawu do wykrywania śmierci komórek In Situ, TMR Red (Roche Diagnostics) na tkance zanurzonej w parafinie zebranej z nowotworów zgodnie z instrukcjami producenta. Barwienie kontrastowe DAPI zastosowano do ilościowego oznaczenia komórek z nienaruszonymi jądrami. Procent komórek TUNEL-dodatnich obliczono dzieląc liczbę komórek TUNEL-dodatnich przez liczbę jąder DAPI-dodatnich przy powiększeniu x100 dla 4 pól dla każdego pobranego guza. Do obrazowania fluorescencyjnego GFP-LC3, Myc / p53ERTAM / GFP-LC3, p53 + / + GFP-LC3 i p53 p / a GFP-LC3 (patrz poniżej) komórki eksponowano na wskazane działania i utrwalano 4% paraformaldehydem przez 30 minut w temperaturze pokojowej, przemyto 3 razy i odwirowano na szkiełkach. Barwienie kontrastowe DAPI zastosowano do identyfikacji komórek z nienaruszonymi jądrami. Wykonano obrazowanie fluorescencyjne i przechwycono cyfrowo przy powiększeniu x100 w mikroskopie fluorescencyjnym Nikon Eclipse E800. Konstrukty, infekcja retrowirusowa i interferencja RNA. Promotor U6 i sekwencja spinki do włosów wektora pLKO-puro niezwiązanego z shRNA (Sigma-Aldrich) sklonowano w TOPO pCR 2.1 (Invitrogen), a fragment BamHI / SnaBI wycięto i sklonowano w wektorze ekspresyjnym pKD, aby wytworzyć wektor HC. Dwie odrębne sekwencje SHRNA przeciwko ATG5 (shATG5 h2, shATG5 h7) zostały wygenerowane i sklonowane do wektora ekspresyjnego pKD (zbudowanego z pBABE-GFP), jak opisano wcześniej (9). Plazmid MIGR1 / GFP-LC3 skonstruowano przez klonowanie miejsca XhoI 5. do sekwencji kodującej GFP-LC3 wektora pEGFP-C1 / LC3 (hojny dar T. Yoshimori, CREST, Japan Science and Technology Agency, Kawaguchi-Saitama, Japonia)
[więcej w: produkty o niskim indeksie glikemicznym wykaz, badanie psychotechniczne, sebidin plus ]
[podobne: koprolalia, sebidin plus, koszulka ratownictwo medyczne ]
[patrz też: koprolalia, sebidin plus, koszulka ratownictwo medyczne ]