Hamowanie autofagii zwiększa apoptozę indukowaną terapią w modelu chłoniaka indukowanym przez Myc ad 11

Fragment XhoI / EcoRI zawierający region kodujący genu fuzyjnego GFP-LC3 wprowadzono do miejsca wielokrotnego klonowania MIGR1 w celu wytworzenia plazmidu MIGR1 / GFP-LC3. W celu wytworzenia retrowirusa o wysokim mianie komórki 293T kotransfekowano wektorem retrowirusowym (5 (ig) plus DNA pomocniczy (2,5 ug), stosując Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Zastosowano następujące wektory retrowirusowe: MIGR1 / GFP-LC3, pKD, pKD / HC, pKD / shATG5 h2 i pKD / shATG5 h7. Kondycjonowaną pożywkę zebrano i przesączono przez filtr 0,45- (3M. Supernatanty hodowli następnie użyto do transdukcji komórek Myc / p53ERTAM, MEF p53 + / + i p53 p / pFF. Następnie, 2 x 106 komórek wysiano w ml kondycjonowanej pożywki zawierającej MIGR1 / GFP-LC3, pKD, pKD / HC, pKD / shATG5 h2 lub pKD / shATG5 h7 w obecności 8 ug / ml bromku heksadimetryny (Polybrene. ; Sigma-Aldrich). W przypadku komórek Myc / p53ERTAM dodano świeżą IL-7 i LPS we wskazanych stężeniach na 24-studzienkowej płytce. Komórki adherentne zakażono i inkubowano przez 4-5 godzin. W przypadku komórek w zawiesinie płytki hodowlane wirowano przy 1,015 g przez godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano w 37 ° C przez 2 godziny. Infekcję powtórzono w ten sposób 3 razy. Komórki następnie ponownie zawieszono w odpowiedniej pożywce i hodowano przez 3 dni. Transdukowane komórki sortowano pod kątem komórek GFP-dodatnich (MoFlo; Cytomation) i dalej hodowano. Statystyka. Porównywano średnie za pomocą testu dwustronnego ucznia. P <0,05 uznano za statystycznie istotny we wszystkich obliczeniach. Wszystkie analizy danych zostały wykonane przy użyciu oprogramowania GraphPad QuickCalcs w wersji 1. Materiały uzupełniające Przegląd danych uzupełniających Podziękowania Autorzy pragną podziękować Neelima Shah za pomoc techniczną w zakresie mikroskopii elektronowej oraz Qian-Chun Yu, Hongwei Yu i Yan Wang za pomoc techniczną w przetwarzaniu tkanek. Chcielibyśmy również podziękować członkom Laboratorium Thompsona, szczególnie Rolandowi Knoblauchowi, Russellowi Jonesowi, Monice Buzzai i Fangpingowi Zhao, za pomocne dyskusje. Wsparcie udzielone przez NIH (R25-CA87812 dla RK Amaravadi, R01-CA 102709 dla D. Yu i A. Thomas-Tichhonenko i R01-CA104838-01A1 dla T. Bui i CB Thompson) oraz dla Białaczki i Towarzystwa Chłoniaków (do JJ Lum). Przypisy Niestandardowe skróty: BECN1, beclin 1; CQ, chlorochina; ER, receptor estrogenowy; h2, szpilka do włosów 2; h7, spinka do włosów 7; HC, kontrola szpilki do włosów; HCQ, hydroksychlorochina; hTAM, 4-hydroksytamoksyfen; LC3, ssaczy homolog z drożdżami Atg8; MEF, mysi zarodkowy fibroblast; MNNG, N-metylo-N a-nitro-N-nitrozoguanidyna; shRNA, krótkie RNA o strukturze spinki do włosów; TAM, tamoksyfen. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J. Clin. Invest.117: 326. 336 (2007). doi: 10.1172 / JCI28833 [hasła pokrewne: produkty o niskim indeksie glikemicznym wykaz, objawy głodu alkoholowego, colgate max white one active ] [hasła pokrewne: jaskółcze ziele zastosowanie, aulin ulotka, przeziernosc karkowa ] [podobne: jaskółcze ziele zastosowanie, aulin ulotka, przeziernosc karkowa ]