Hamowanie autofagii zwiększa apoptozę indukowaną terapią w modelu chłoniaka indukowanym przez Myc ad 5

Przedstawiono reprezentatywne obrazy komórek po 48 godzinach. (B) Kwantyfikacja odsetka komórek z więcej niż 4 punktami GFP-LC3 na komórkę (punktowane) w porównaniu z tymi z mniej niż 4 punktami GFP-LC3 na komórkę (dyfuzyjnie) traktowanymi wzrastającymi dawkami CQ zi bez hTAM w 24 godziny. (C) CQ moduluje autofagię w sposób niezależny od p53. p53 + / + i p53. /. Ekspresjonujące MEF GFP-LC3 traktowano CQ. Komórki utrwalono i zobrazowano przez 24 godziny. Aby potwierdzić, że działanie przeciwnowotworowe CQ obserwowane in vivo wynika ze zdolności CQ do hamowania przeżycia opartego na autofagii, leczenie CQ komórek nowotworowych porównano z genetycznym zahamowaniem autofagii za pomocą shRNA przeciwko genowi autofagii ATG5 (shATG5). Ekspresja shATG5 blokuje autofagię na proksymalnym etapie, zapobiegając tworzeniu kompleksu ATG5-ATG12, który jest wymagany do generowania autofagosomów (24). shRNA zaprojektowany do wyciszania żadnych genów myszy lub ludzi (kontrola spinki do włosów, HC) i 2 odrębne sekwencje shRNA przeciwko ATG5 (spinka do włosów shATG5 2 [h2], spinka shATG5 [h7]) zostały sklonowane do kontrolnego wektora ekspresyjnego pKD (9) i wprowadzone do pierwotne komórki nowotworowe zebrane z chłoniaka z komórek B Myc / p53ERTAM. Zmniejszone poziomy ekspresji kompleksu ATG5-ATG12 w komórkach wyrażających shATG5 h2 (h2) i shATG5 h7 (h7), ale nie w komórkach wyrażających HC (HC) lub wektor (V), potwierdzono metodą Western blot (Figura 5A). Komórki nowotworowe indukowano apoptozą, gdy p53 aktywowano przez traktowanie hTAM in vitro. Aktywacja p53 za pomocą hTAM w komórkach h2 i h7, w których poziomy ATG5 były przewlekle tłumione, powodowała zwiększoną śmierć komórek w porównaniu z komórkami HC (Figura 5B). Opisano, że autofagia promuje przeżycie komórek w odpowiedzi na stres poprzez zarówno zdolność usuwania uszkodzonych organelli (25), jak i zdolność do recyklingu zawartości wewnątrzkomórkowej w celu utrzymania bioenergetyki (26). Aby ustalić, czy proapoptotyczny wpływ przewlekłej supresji autofagii można odwrócić, dostarczając przepuszczalnego składnika odżywczego w celu wsparcia bioenergetyki, komórki traktowano hTAM i pirogronianem metylu. Pirogronian metylu jest pośrednim w komórkach metabolizmem glukozy, o którym wcześniej informowano, że zachowuje żywotność czynnika wzrostu. i / lub komórki zubożone w składniki odżywcze, w których upośledzona jest autofagia (9). Dodatek metanopirogronianu do pożywki nie zdołał uratować zwiększonej śmierci komórek obserwowanej w komórkach h2, jak również komórkach h7 po aktywacji p53 za pomocą hTAM (Figura 5C). Figura 5 Wpływ aktywacji p53 z i bez knockdown ATG5 na śmierć komórek nowotworowych. (A) Western blot przeciwko ATG5 lizatów z Myc / p53ERTAM / komórki wektorowe (V), komórki Myc / p53ERTAM / HC (HC), komórki Myc / p53ERTAM / shATG5 h2 (h2) i komórki Myc / p53ERTAM / shATG5 h7 ( h7). Actin była używana jako kontrola obciążenia. (B) Aktywacja p53 w komórkach HC i shATG5. Komórki chłoniaka HC, h2 i h7 traktowano codziennie 200 nM hTAM. (C) Aktywacja p53 z pirogronianem metylu (MP). Komórki chłoniaka HC, h2 i h7 traktowano codziennie hTAM plus mM MP. (B i C) Żywą liczbę komórek określoną przez wykluczenie błękitem trypanowym zliczano codziennie. Zgłoszone wartości są średnie. SD z trzech próbek z reprezentatywnego doświadczenia. Wpływ traktowania CQ na śmierć komórek nowotworowych po aktywacji p53 za pomocą hTAM badano w komórkach stabilnie transfekowanych HC lub z 2 różnych wektorów wyrażających shATG5 (h2, h7; Figura 5A). Traktowanie CQ (1. 5. M) komórek HC zwiększało śmierć komórek nowotworowych w odpowiedzi na indukcję p53 w sposób zależny od dawki (Figura 6A). W tym zakresie dawek sam CQ nie miał powtarzalnego wpływu na żywotność lub proliferację komórek guza (Dodatkowa Figura 1, dostępny online z tym artykułem; doi: 10.1172 / JCI28833DS1). W przeciwieństwie do tego, traktowanie CQ nie poprawiło śmierci komórek ani klonu komórek transfekowanych shATG5 w tych dawkach (Figura 6, B i C). Figura 6: Skutki knockdown CQ lub ATG5 w połączeniu z aktywacją p53 w przypadku śmierci komórek nowotworowych. (A) Aktywacja p53 plus CQ w komórkach HC. Komórki chłoniaka HC były leczone codziennie 200 nM hTAM plus 1. M, 3. M lub 5. M CQ. (B) Aktywacja p53 plus CQ w komórkach chłoniaka h2. Komórki HC były leczone codziennie hTAM i porównywane z komórkami h2 traktowanymi codziennie hTAM lub hTAM plus 1. M, 3. M lub 5. M CQ. (C) Aktywacja p53 plus CQ w komórkach chłoniaka h7. Komórki HC były leczone codziennie hTAM i porównywane z komórkami h7 traktowanymi codziennie hTAM lub hTAM plus 1. M, 3. M lub 5. M CQ. (A (C) Żywą liczbę komórek określoną przez wykluczenie błękitem trypanowym zliczano codziennie. Zgłoszone wartości są średnie. SD z trzech próbek z reprezentatywnego doświadczenia. CQ wzmacnia regresję nowotworu i hamuje nawrót guza po alkilowaniu terapii lekowej
[więcej w: jaskółcze ziele zastosowanie, rehabilitacja po zerwaniu ścięgna achillesa, microgynon ulotka ]
[patrz też: microgynon ulotka, dicortineff ulotka, ibum forte ulotka ]
[patrz też: microgynon ulotka, dicortineff ulotka, ibum forte ulotka ]