Hamowanie autofagii zwiększa apoptozę indukowaną terapią w modelu chłoniaka indukowanym przez Myc czesc 4

Jako niezależny pomiar apoptozy komórek nowotworowych w leczonych nowotworach, przeprowadzono analizę Western blot pociętej kaspazy-3 na lizatach komórek nowotworowych z guzów traktowanych TAM / PBS i TAM / CQ. Zwiększoną rozszczepioną kaspazę-3 obserwowano w lizatach nowotworów uzyskanych w 8 godzin po rozpoczęciu TAM / PBS lub TAM / CQ. Rozszczepiona kaspaza-3 była nieobecna w lizatach komórek nowotworowych traktowanych TAM / PBS otrzymanych po 48 godzinach, ale obecnych w lizatach nowotworów traktowanych TAM / CQ otrzymanych po 48 godzinach (danych nie przedstawiono). Figura 3 Wpływ aktywacji p53 zi bez CQ na apoptozę. (A) indukowana CQ śmierć komórki po aktywacji p53. Mikrografy elektronowe tkanek chłoniaka zebrane przed leczeniem TAM i po 48 godzinach TAM / PBS lub TAM / CQ. Paski skali: 10 .m. Oryginalne powiększenie, × 4000. (B) Kwantyfikacja komórek nowotworowych z morfologicznymi dowodami apoptozy. Mikroskopię elektronową (EM) wykonano na chłoniakach Myc / p53ERTAM we wskazanych punktach czasowych pod podanymi protokołami leczenia. Procent komórek apoptotycznych na pole przy powiększeniu 4000 razy określono sposobem opisanym w metodach (średnia . SD). (C) Barwienie TUNEL przeprowadzono na tkance otrzymanej z leczonych guzów we wskazanych punktach czasowych. Reprezentatywne obrazy uzyskano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Czerwona fluorescencja wskazuje komórki TUNEL-dodatnie. Niebieska fluorescencja wskazuje na barwienie jądrowe DAPI. (D) Kwantyfikacja komórek nowotworowych TUNEL-dodatnich. Procent komórek TUNEL-dodatnich na pole o dużej mocy jest podawany jako średnia. SD. CQ wzmacnia zależną od p53 apoptozę poprzez hamowanie autofagii. Aby upewnić się, że zmiany w liczbie autofagosomów obserwowane w mikroskopie elektronowym wynikają z bezpośredniego działania podawanych ogólnoustrojowo leków na szlak autofagii w komórkach nowotworowych, a nie ze zmian mikrośrodowiska guza wywołanych przez zwyrodnienie guza po leczeniu, GFP-LC3 (LC3 gen fuzji ssaczego homologa drożdży Atg8) poddano retrowirusowej transdukcji do objętościowej populacji komórek zebranych z pierwotnego chłoniaka Myc / p53ERTAM, a komórki GFP-dodatnie pasażowano w hodowli. LC3 jest przetwarzany z LC3-I do LC3-II podczas autofagii. LC3-II wprowadza się do nowo utworzonych autofagosomalnych membran (22). Ekspresja GFP-LC3 zapewnia środki do śledzenia zmian w tworzeniu autofagosomu w żywych komórkach (23). Dystrybucja GFP-LC3 w nietraktowanych komórkach Myc / p53ERTAM / GFP-LC3 była dyfuzyjnie cytoplazmatyczna (Figura 4A). Zdolność CQ do modulowania autofagii w komórkach nowotworowych potwierdzono przez akumulację pęcherzyków LC3-pozytywnych po traktowaniu komórek Myc / p53ERTAM / GFP-LC3 za pomocą CQ. Aktywacja p53 z 4-hydroksytamoksyfenem (hTAM) skutkowała zwiększoną liczbą punktowych pęcherzyków związanych z LC3, którą dodatkowo zwiększono przez skojarzone traktowanie hTAM i CQ. Akumulacja autofagosomów w komórkach traktowanych CQ była zależna od dawki, zarówno pod względem nieobecności, jak i obecności hTAM (Figura 4B). W nieobecności hTAM, dawki CQ pomiędzy 500 nM a 5 (3M powodowały dwukrotny do 10-krotny wzrost odsetka komórek z punktową fluorescencją GFP-LC3. Leczenie samym hTAM spowodowało 10-krotny wzrost odsetka komórek z punktową fluorescencją GFP-LC3. Dodanie CQ (1 – 5 (3M) podczas leczenia hTAM spowodowało zależny od dawki wzrost odsetka komórek z punktową fluorescencją GFP-LC3. Różnice te utrzymywały się bez znaczącej zmiany po pomiarze 48 godzin po leczeniu (dane nie przedstawione). W celu zapewnienia, że zdolność CQ do modulowania autofagii była niezależna od mysich embrionalnych fibroblastów p53 p53, p53 + / + GFP-LC3 i p53 p / PFF-LC3 (MEF). CQ indukowało gromadzenie punk- talnych pęcherzyków związanych z LC3 w MEF w sposób niezależny od p53 (Figura 4C). Traktowanie MEF p53 + / + GFP-LC3 hTAM nie powodowało punktowej fluorescencji LC3 (dane nie przedstawione). Wynik ten potwierdził, że punktowa fluorescencja LC3 obserwowana w komórkach chłoniaka Myc / p53ERTAM traktowanych hTAM była spowodowana indukowaną przez hTAM aktywacją białka fuzyjnego p53ERTAM. Ponieważ domena białkowa ERTAM jest transkrypcyjnie inaktywowanym ER, punktacja fluorescencji GFP-LC3 w komórkach Myc / p53ERTAM traktowanych hTAM jest efektem, w którym pośredniczy p53. Figura 4 Wpływ aktywacji p53 zi bez CQ na relokalizację LC3. (A | C) fluorescencja GFP-LC3. Zielony, GFP-LC3; niebieski, DAPI. (A) Ogromna populacja pierwotnych komórek chłoniaka Myc / p53ERTAM o stabilnej ekspresji białka fuzyjnego GFP-LC3 była leczona zi bez 250 nM hTAM i zi bez 5. M CQ. Pożywkę do hodowli komórek zmieniano codziennie. Komórki utrwalono i zobrazowano przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej po 24 i 48 godzinach
[przypisy: jaskółcze ziele zastosowanie, zdrowa żywność zdrowy styl życia, malowanie włosów w ciąży ]
[hasła pokrewne: aulin ulotka, przeziernosc karkowa, debutir ulotka ]
[hasła pokrewne: aulin ulotka, przeziernosc karkowa, debutir ulotka ]