Hepatic Niemann-Pick C1 Jak 1 reguluje stężenie cholesterolu w żółci i jest celem ezetymibu ad

Białko o nieznacznie różnej wielkości zaobserwowano w nerkach myszy L1-Tg, ale uznano, że nie jest NPC1L1, ponieważ było również obserwowane w nerkach myszy WT. NPC1L1 jest silnie N-glikozylowany (3, 10). Około 175 kDa białka oznacza N-glikozylowaną NPC1L1 w wątrobach L1-Tg, ponieważ trawienie N-glikozydazą spowodowało zmniejszenie pozornej wielkości białka do około 145 kDa (Figura 1B), przewidywaną masę cząsteczkową NPClL1. Względny poziom ekspresji ludzkiego transgenu NPC1L1 w wątrobie myszy L1-Tg20 i L1-Tg112 był odpowiednio około 3,5- i 5,7-krotnie wyższy niż obserwowany w ludzkich komórkach hepatocarcinoma HepG2, w oparciu o densytometrię ludzkich immunoblotów NPC1L1 taką samą ilość homogenatów całych tkanek lub lizatów komórkowych (Figura 1C). Białko NPC1L1 było łatwo wykrywalne z 50 .g świeżych ludzkich hepatocytów i ludzkich lizatów wątrobowych (Figura 1D). Interesujące jest to, że w 7 zebranych ludzkich wątrobach obserwowano istotną międzyindywidualną zmianę poziomu białka NPC1L1 w wątrobie. Gdy ilość NPC1L1 została znormalizowana przez glikoproteinę, białko związane z receptorem (RAP) (21), jej poziom w wątrobie L1-Tg20 wynosił około 86% w ludzkiej wątrobie (Figura 1D); jednak gdy białko NPC1L1 było normalizowane przez stężenie białka stosowane do immunoblottingu, jego poziom był około 20-krotnie wyższy w wątrobie L1-Tg20 w porównaniu z próbką ludzkiej wątroby. Niewielkie różnice w wielkości białka NPC1L1 obserwowano w różnych tkankach i komórki (Figura 1D), które mogą reprezentować różnicową glikozylację NPC1L1 w tych tkankach i komórkach, ponieważ trawienie N-glikozydazy spowodowało przesunięcie białka z myszy i ludzkich próbek do podobnej pozycji (Figura 1E). Stopień N-glikozylacji NPC1L1 może być mniejszy w wątrobie ludzkiej niż w wątrobie gryzoni. Może to tłumaczyć, dlaczego rozmiar białka NPC1L1 był mniejszy w tkance ludzkiej wątroby niż w wątrobie myszy (ryc. 1D). Niewidzialna zmiana silnego niższego pasma białka NPC1L1 w tkance ludzkiej wątroby (Figura 1E) może sugerować, że większość NPC1L1 była nieznacznie N-glikozylowana w zebranej tkance ludzkiej wątroby. Gdy duże białko jest lekko glikozylowane, deglikozylacja nie spowoduje widocznego przesunięcia wielkości białka. Mniejszy rozmiar RAP u ludzi i gryzoni był zgodny z poprzednim raportem (22). Figura 1NPC1L1 jest wyrażany w myszach L1-Tg i ludzkich tkankach wątroby. (A) Tkanki zebrano od 3 samców myszy L1-Tg112 (w wieku 3 miesięcy) i równe ilości tkanki od każdej myszy połączono i poddano obróbce w celu przygotowania białek błonowych, jak opisano wcześniej (50). Białka błonowe z nadnerczy (25 .g) i inne tkanki (50 .g) frakcjonowano za pomocą 8% żelu poliakryloamidowego w obecności SDS i poddano immunoblottingowi z króliczym przeciwciałem przeciwko ludzkiemu NPC1L1 (anty-hNPC1L1) (L1Ab) (10 ) i króliczą surowicę anty-szczurzy RAP (21). RAP został użyty jako kontrola obciążenia. Ścieżki i 2, wątroba; ścieżka 3, czczo; ścieżka 4, nerka; ścieżka 5, trzustka; ścieżka 6, płuco; ścieżka 7, serce; ścieżka 8, śledziona; ścieżka 9, mięsień; ścieżka 10, jądra; ścieżka 11, mózg; ścieżka 12, móżdżek; ścieżka 13, tłuszcz najądrzy; ścieżka 14, nadnercza. Podobne wyniki zaobserwowano u myszy L1-Tg20. (B) Białka błony (50 .g) od myszy L1-Tg112 traktowano z lub bez peptydu: N-glikozydaza F (PNGazęF, New England Biolabs), a następnie immunoblotting z użyciem L1Ab. (C) Homogenaty wątroby myszy i lizaty komórek HepG2 poddano immunoblottingowi z przeciwciałami 69B i RAP. (D) Homogenaty wątroby myszy (2,5 .g) i lizaty komórkowe lub ludzkie homogenaty wątroby (50 .g) poddano immunoblottingowi z surowicą przed immunizacją królika, z której uzyskano surowicę 69B. Ta sama membrana była odpędzana i poddawana immunoblottingowi z przeciwciałami 69B i RAP. (E) homogenaty myszy L1-Tg20 (2,5 g) i świeże ludzkie lizaty hepatocytów lub ludzkie homogenaty wątroby (50 .g) deglikozylowano za pomocą peptydu: N-glikozydaza F, a następnie poddano immunoblottingowi z surowicą odpornościową i surowicą odpornościową 69B. Badania immunofluorescencji wykazały, że NPC1L1 kolokalizuje się z kanałową glikoproteiną P, ABCB1 (Figura 2A), demonstrując jej lokalizację kanału w wątrobie L1-Tg. W wątrobie WT nie stwierdzono barwienia NPC1L1. Dodatkowo, NPC1L1 nie wykazywał kolokalizacji z przewodami żółciowymi z dróg żółciowych (Figura 2B), co wskazuje, że ekspresja NPC1L1 jest specyficzna względem hepatocytów. Stwierdzono również, że NPC1L1 lokalizuje się w błonie kanałowej w wątrobie ludzkiej za pomocą immunohistocytochemii fluorescencyjnej (Figura 2C). Figura 2NPC1L1 lokalizuje się na błonie kanałowej w L1-Tg i ludzkich tkankach wątroby
[przypisy: dieta przy dnie moczanowej tabela, rehabilitacja po zerwaniu ścięgna achillesa, twardzina układowa objawy ]
[podobne: koprolalia, sebidin plus, koszulka ratownictwo medyczne ]
[hasła pokrewne: koprolalia, sebidin plus, koszulka ratownictwo medyczne ]