IL-33 i ST2 obejmują krytycznie indukowany biomechanicznie i kardioprotekcyjny układ sygnalizacyjny ad 10

Naczynia delikatnie zeskrobano, a jądra zebrano przez odwirowanie przy 800 g przez 30 sekund, a następnie zawieszono w roztworze 50 mM HEPES, 400 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 10% glicerolu, mM DTT, 0,5 mM PMSF i 10 y / ml leupeptyny. Mieszaninę inkubowano na lodzie przez 30 minut, a supernatant zebrano po odwirowaniu przez 15 minut przy 400 g. Reakcje wiązania przeprowadzono za pomocą 5 lub 10 .g białka jądrowego w 10 mM Tris, mM DTT, mM EDTA, 5% glicerolu, 0,1% Triton X-100, mg poli (d1dC), 5 .g BSA, i 10 000 cpm znakowanego [32P] oligonukleotydu. Konkretnymi oligonukleotydami konsensusowymi NF-kB były 5 (3 -AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3. i 5. -GCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3. (Promega). Pozytywne i negatywne mieszaniny kontrolne, jak również specyficzne mieszaniny kompetycyjne, zostały wykonane zgodnie z zaleceniami producenta, z użyciem bufora wiążącego z dodatnimi próbkami, znakowanych oligonukleotydów NF-kB i 10-krotnego nadmiaru zimnych konsensusowych oligonukleotydów NF-kB dla określonej konkurencji. Kompleksy DNA rozdzielono na 6% nieodróżniającym się żelu poliakryloamidowym w Tris-HCl (6,7 mM), EDTA (1 mM) i octanie amonu (3,3 mM). Test lucyferazy NF-kB. Noworodkowe kardiomiocyty szczurów transfekowano przy użyciu Lipofectamine Plus (Invitrogen) z plazmidem reporterowym lucyferazy dla NF-kB i p-galaktozydazą, jak opisano poprzednio (47). Po 48 godzinach transfekcji komórki stymulowano przez dodatkowe 24 godziny, poddawano lizie, traktowano układem testu Dual-Light (Applied Biosystems) i analizowano za pomocą luminometru (PerkinElmer). Badanie stresu oksydacyjnego. Przeprowadzono test wykrywający stres oksydacyjny, jak opisano wcześniej (48). Cardiomyocyty inkubowano z dioctanem 2,7-dichlorodihydrofluoreceiny (DCFDA, Molecular Dynamics Inc.) przez 45 minut i płukano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, a intensywność fluorescencji mierzono za pomocą fluorometru (PerkinElmer) przy 595 nm. Immunoprecypitacja. Immunoprecypitację przeprowadzono jak opisano uprzednio (45) z pewnymi modyfikacjami. W skrócie, po przemyciu PBS, perełki białka agarozy G. Prekondycjonowano z nadmiernie dużą ilością ludzkiego białka sST2-Fc (R & D Systems) w temperaturze 4 ° C przez noc, a następnie przemyto 3 razy PBS. Kondycjonowane pożywki (1 ml) z preinkubacją białka 20STg sST2-Fc lub bez niej inkubowano następnie z nasyconymi paskami przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Analiza zachodnia. Analizy zachodnie przeprowadzono jak opisano wcześniej (45). Błony (PVDF, PerkinElmer) inkubowano przez noc z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciw p44 / 42 MAPK, rozcieńczonym 1: 500; fosforylowane p44 / 42 MAPK (Thr202 / Tyr204), rozcieńczone 1: 1000; fosforylowany JNK (Thr183 / Tyr185), rozcieńczony 1: 500; p38 MAPK, rozcieńczony 1: 500; fosforylowane p38 MAPK (Thrl80 / Tyr182), rozcieńczone 1: 500; fosforylowany Akt (Ser473), rozcieńczony 1: 1000; fosforylowane I (3B, rozcieńczone 1: 1000; p65 / NF-P B, rozcieńczony 1: 1000; i fosforylowane p65 / NF-kB, rozcieńczone 1: 1000 (wszystkie z Cell Signaling Technology); anty-mysz ST2L, rozcieńczony 1: 1000 (systemy R & D); i antyA IL-33, rozcieńczony 1: 500 (Maine Biotechnology) w temperaturze 4 ° C, wykrywany przez przeciwciała skoniugowane z HRP (Bio-Rad) i wzmocniona chemiluminescencja. TAC i leczenie białkiem IL-33. Ukierunkowane ST2. /. myszy i ich dzieci z miotu WT użyto do eksperymentów. TAC wytworzono jak opisano wcześniej (49, 50) u myszy w wieku 8 do 10 tygodni. Wszystkie procedury operacyjne zostały wykonane przez jednego operatora z ponad 20 lat. doświadczenie w kardiochirurgii gryzoni, który był zaślepiony na genotyp i randomizowane przypisanie do leczenia. Po procedurze każda mysz otrzymywała codzienne iniekcje ip rekombinowanej szczurzej IL-33 (2 (ig) lub nośnika od dnia po indukcji TAC aż do dnia zbioru. Echokardiografia. Echokardiograficzną akwizycję i analizę wykonał echokardiograf bez grupy leczonej. Lekkie znieczulenie ze spontanicznym oddychaniem osiągnięto za pomocą dootrzewnowego pentobarbitalu (10 .g / g). Wszystkie obrazy wykonano z częstością rytmu serca wyższą niż 400 uderzeń na minutę, aby zminimalizować efekty znieczulenia, stosując system echosardiografii Sonos-4500 (Philips) i przetwornik 15 MHz (Philips). Zastosowano średnią z 3 kolejnych cykli kardiologicznych. Masę lewej komory obliczono metodą M-mode (51). Skrócenie frakcyjne lewej komory było obliczane w procentach w następujący sposób: (EDD. ESD) / EDD × 100, gdzie EDD ma wymiar końcowo-rozkurczowy, a ESD to wymiar końcowy skurczowy. Obliczone i rzeczywiste masy (pobrane podczas autopsji) miały doskonałą korelację (r = 0,88, P <0,0001, n = 50 myszy od do 4 tygodni po TAC). Analiza histologiczna [podobne: piramida zdrowego zywienia, tobrosopt dex, typy osobowości wg junga ] [przypisy: octenisept ulotka, koszulki ratownictwo medyczne, tobrosopt dex ] [przypisy: octenisept ulotka, koszulki ratownictwo medyczne, tobrosopt dex ]