IL-33 i ST2 obejmują krytycznie indukowany biomechanicznie i kardioprotekcyjny układ sygnalizacyjny ad 9

Analizę Northern przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem). Autoradiogramy zostały określone ilościowo za pomocą densytometrii (Scion Image 4.0), a poziomy mRNA znormalizowano do densytometrii barwienia bromkiem etidium 18S lub 28S rybosomalnego RNA. Wytwarzanie rekombinowanego szczurzego i ludzkiego białka IL-33 i poliklonalnego przeciwciała przeciw szczurzej IL-33. Numery dostępu GenBank dla szczurzej i ludzkiej IL-33 to odpowiednio BC081993 i AY905581. Szczurzej lub ludzkie cDNA IL-33 subklonowano do wektora ekspresyjnego pTrcHis-TOPO (Invitrogen), zaczynając od aminokwasu 109 lub 112 pełnej długości szczura lub ludzkiego białka, odpowiednio, z N-końcowym znacznikiem His. Po sekwencjonowaniu, transformowano bakterie One-shot TOP10 (Invitrogen) i indukowano ekspresję za pomocą izopropylo-D-D-1-tiogalaktopiranozydu. Cztery godziny po indukcji zebrano bakterie i osad ponownie zawieszono w B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent (Pierce Biotechnology) z koktajlem bez inhibitorów proteazy bez EDTA. Lizat oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa z udziałem chelatującego Ni, stosując system Ni-NTA Purification (Invitrogen). W skrócie, kulki Ni-NTA przemyto dwukrotnie po wiązaniu partiami 40 ml 20 mM imidazolu, 300 mM NaCl i 50 mM fosforanu potasu, pH 8,0. IL-33 eluowano 10 ml 250 mM imidazolu, 300 mM NaCl i 50 mM fosforanu potasu, pH 8,0. Białko IL-33 było dalej zatężane, dializowane i oczyszczane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (BioLogic DuoFlow System, Bio-Rad) przy użyciu kolumny HiPrep sephacryl z wykluczeniem wielkości (GE HealthCare) z buforem zawierającym 150 mM NaCl i 50 mM fosforan potasu, pH 7,2. Poziom endotoksyny (<0,03 EU / g białka) oznaczono metodą Limulus Amebocyte Lysate PYROGENT Ultra (Cambrex), jak opisano wcześniej (12). Wykorzystując to białko, stworzyliśmy poliklonalne anty-szczurzą przeciwciało IL-33 u królików (Maine Biotechnology) i oczyszczono przeciwciało za pomocą chromatografii powinowactwa z białkiem A. Test Pulldown pomiędzy rekombinowaną IL-33 z His i mysią chimerą ST2L-Fc (R & D Systems) przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (12) z pewną modyfikacją, tj. Stosując kulki Ni-NTA (Invitrogen) i przeciwciało anty-HisG (Invitrogen). zamiast odpowiednio sprzężonej z agarozą awidyny D i koniugatu streptawidyna-HRP, a następnie odpowiedniej reakcji wtórnego przeciwciała sprzężonego z HRP (Bio-Rad) przez godzinę w temperaturze pokojowej i zwiększonej chemiluminescencji. Test inkorporacji [3H] -Lucyny. Włączenie leucyny do kardiomiocytów noworodków szczura wykrywano jak opisano wcześniej (46). Komórki traktowano 1,0 Ci / ml [3H] -leucyny (PerkinElmer) przez 24 godziny, przemyto i utrwalono 10% trichlorooctanem przez 45 minut w temperaturze 4 ° C, po czym radioaktywność oznaczono metodą zliczania scyntylacyjnego w cieczy (Beckman Coulter) . Użyliśmy szczurzego anty-mysiego przeciwciała monoklonalnego ST2L (R & D Systems) jako funkcjonalnego przeciwciała neutralizującego, jak podano wcześniej (12). Użyliśmy również normalnej szczurzej IgG2a i ludzkiej chimerowej 2-Fc chimerowej IL-1Rp (R & D Systems) jako kontroli dla szczurzego przeciwciała przeciw myszy monoklonalnego ST2L i ludzkiej chimerowej sST2-Fc (R & D Systems), odpowiednio. Mikroskopia fluorescencyjna. Barwienie immunofluorescencyjne na osadzonych w parafinie sercowych myszach lub szczurzych hodowlach komórek kardiomiocytów szczura przeprowadzono jak opisano wcześniej (42, 45). Oprócz króliczego przeciwciała poliklonalnego anty-IL-33 (rozcieńczone 1: 100, Maine Biotechnology), mysiego monoklonalnego (przeciw-wimentynie, rozcieńczonego 1: 100, Abcam, pozycja 42) i koziego poliklonalnego (receptor domeny anty-dyskoidowej. 2 rozcieńczone 1:50; Santa Cruz Biotechnology Inc, nr ref. 4, 15) zastosowano przeciwciała do wykrycia fibroblastów w oddzielnych próbkach. Próbki wizualizowano za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego (IX-70; Olympus). Aby zmierzyć rozmiar kardiomiocytów, pole powierzchni komórek obliczono za pomocą oprogramowania ImagePro Express. Analizowano komórki z losowo wybranych pól. Immunohistochemia i analiza TUNEL. Formowane w formalinie skrawki zatopione w parafinie zostały przygotowane zgodnie z wcześniejszym opisem (42). W przypadku immunohistochemii, pierwsze użyte przeciwciała to anty-rozszczepiona kaspaza-3 (Cell Signaling Technology) i anti-mac3 (BD Biosciences). Do analizy TUNEL stosowano zestaw do wykrywania apoptozy In situ (Chemicon) zgodnie z protokołem producenta z pewnymi optymalnymi modyfikacjami okresów leczenia w celu skrócenia czasu reakcji z DAB w ciągu minuty. EMSA. EMSA przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (47). Komórki poddawano lizie przez 10 minut na lodzie w 10 mM HEPES (pH 7,6), 15 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, mM DTT, 0,5 mM PMSF, 10 (ag / ml leupeptyny i 0,2% Nd. 40 [przypisy: aspargin ulotka, co dziś zjem na śniadanie, koszt ubezpieczenia zdrowotnego ] [więcej w: dieta przy dnie moczanowej tabela, aspargin ulotka, clotrimazolum ulotka ] [przypisy: dieta przy dnie moczanowej tabela, aspargin ulotka, clotrimazolum ulotka ]