IL-33 i ST2 obejmują krytycznie indukowany biomechanicznie i kardioprotekcyjny układ sygnalizacyjny ad

Cykliczny szczep biomechaniczny (8%, Hz) indukował ekspresję zarówno IL-33, jak i sST2 w obu typach komórek. W ocenie innych bodźców ilościowa reakcja PCR wykazała, że 13-octan 12-mirystynianu forbolu (PMA 0,2. M) i angiotensyna II (0,1. M) również indukowały ekspresję IL-33 w obu typach komórek; przeciwnie, ani TNF-a (10 ng / ml) ani IL-1 p (10 ng / ml) indukował ekspresję genu IL-33 (dane nie pokazane). Figura 1IL-33 jest indukowana przez mechaniczne szczepienie fibroblastów serca. (A i B) Ilościowe analizy ekspresji genu IL-33 za pomocą ilościowego PCR (A) i sST2 przez analizę Northern (B) w kardiomiocytach noworodków szczura (białe słupki) i fibroblastach (czarne słupki) pokazano powyżej z reprezentatywnymi obrazami z Northern analizy RNA fibroblastów serca. Komórki poddano cyklicznemu naprężeniu (8%, Hz) we wskazanych okresach. Wartości odnoszą się do ekspresji a-tubuliny i są wyrażone jako procent kontroli w fibroblastach serca. Dane pochodzą z co najmniej 3 zestawów niezależnych eksperymentów. * P <0,05, ** P <0,01 względem linii podstawowej. (C) Barwienie metodą Coomassie wykazało, że rekombinowany dojrzały szczurzy i ludzka IL-33 z N-końcowym znacznikiem His (odpowiednio załadowane 10 i 3 | ig białka) miały wysoką czystość. (D) Test rozwijania rekombinowanej szczurzej IL-33 z mysim białkiem ST2L-Fc. Rekombinowane białko wykazywało specyficzne wiązanie z mysim ST2. (E) Analiza Western kardiomiocytów i sercowych fibroblastów poddanych cyklicznemu szczepowi (każda próbka białka o masie 10 .g z lizatu całych komórek) we wskazanych okresach. Dla porównania, 0,1 ng zrekombinowanej IL-33 zastosowano na prawym pasie. (F) Reprezentatywne obrazy mikroskopii immunofluorescencyjnej próbek lewej komory tydzień po operacji pozorowanej lub TAC. Przeciwciało anty-wimentynowe (górne panele) lub przeciwciało przeciw receptorowi .-dys- kowidyny (DDR-2, dolne panele) zastosowano do wykrywania fibroblastów (czerwone) do podwójnego barwienia za pomocą IL-33 (zielony). Przeciążenie ciśnieniowe wywołane przez TAC wywoływało ekspresję IL-33, szczególnie w komórkach śródmiąższowych bez kardiomiocytów. Pasek skali: 10 .m. Następnie eksprymowaliśmy i oczyszczono rekombinowany szczurzy i ludzką IL-33 stosując chromatografię powinowactwa. Oba rekombinowane białka IL-33 miały wysoką czystość, ponieważ zarówno elektroforeza poliakryloamidowa, jak i barwienie Coomassie wykazały pojedyncze pasmo (Figura 1C) i oczyszczoną IL-33 związaną z mysim białkiem ST2, jak wykazano przez pulsowanie IL-33 przy użyciu rekombinowane białko chimerowe ST2L-Fc (Figura 1D). Poziomy endotoksyn w oczyszczonej IL-33 były niewykrywalne w teście z lizatem amebocytów Limulus (<0,03 EU / g białka). Wznieśliśmy króliczą poliklonalną surowicę odpornościową przeciwko szczurzej IL-33 i oczyszczono przeciwciała z surowicy przez chromatografię powinowactwa. Analiza Western wykazała, że podstawowa ekspresja białka IL-33 przez fibroblasty w sercu była znacznie większa niż w kardiomiocytach, a cykliczny szczep biomechaniczny (8%, Hz) indukował białko IL-33 w obu typach komórek (Figura 1E). W warunkach in vivo, immunofluorescencyjne barwienie mysiego miokardium wykazało, że przeciążenie ciśnieniem wywołane przez poprzeczne zwężenie aorty (TAC) zwiększyło ekspresję białka IL-33 w śródmiąższowych komórkach serca bardziej niż w kardiomiocytach (Figura 1F). Barwienie immunofluorescencyjne przeciwciałami przeciwko wimentynie, a także receptorem domeny 2 disoberydyny (DDR-2). który jest wyrażany przez fibroblasty serca, ale nie przez komórki śródbłonka, komórki mięśni gładkich lub kardiomiocyty (4, 15). ujawniły prawie identyczne wyniki (ryc. 1F). Aby określić wpływ IL-33 wydzielanej przez fibroblastę serca na sąsiadujące kardiomiocyty, hodowane szczurzą kardiomiocyty noworodków leczono rekombinowaną IL-33. W powtarzanych eksperymentach IL-33 wykazał skromny, zależny od dawki trend prohipertroficzny, który nie był statystycznie istotny (Figura 2A). Jednak IL-33 silnie blokuje przerost kardiomiocytów indukowany przez angiotensynę II lub fenylefrynę w sposób zależny od dawki (Figura 2A). Białko sST2 odwracało antyhipertroficzne działanie IL-33 w sposób zależny od dawki (Figura 2B), wskazując, że sST2 prawdopodobnie działa jako rozpuszczalny receptor wabika przez wiązanie IL-33 i zapobieganie sygnalizacji ST2L. Zablokowanie receptora ST2L przeciwciałem monoklonalnym anty-ST2L wyeliminowało przeciwhipertroficzne działanie IL-33, w przeciwieństwie do kontrolnej IgG (Figura 2C), co pokazuje, że działanie IL-33 jest specyficznie poprzez receptor ST2L. Ponadto, zdolność sST2 do dalszego zwiększania odpowiedzi hipertroficznej przy stymulacji angiotensyną II lub fenylefryną nie była obserwowana w przypadku białka fuzyjnego kontrolnego białka fuzyjnego II białka IL-1R (Figura 2D). Przeciwhipertroficzne działanie IL-33 zostało następnie potwierdzone przez pomiar wielkości komórek in vitro kardiomiocytów (Figura 2E) z lub bez angiotensyny II (0,1. M) lub IL-33 (10 ng / ml), a także zastosowanie antygenu Przeciwciało -ST2L (100 ug / ml), o którym wcześniej informowano, że jest funkcjonalnym inhibitorem sygnalizacji IL-33 / ST2 (12) [przypisy: przygotowanie do rozmowy kwalifikacyjnej, dieta przy dnie moczanowej tabela, aspargin ulotka ] [hasła pokrewne: aspargin ulotka, clotrimazolum ulotka, octenisept ulotka ] [hasła pokrewne: aspargin ulotka, clotrimazolum ulotka, octenisept ulotka ]