Myszy nie posiadające cząsteczki sygnalizującej CalDAG-GEFI reprezentują model niedoboru adhezji leukocytów typu III ad 5

W przeciwieństwie do aktywowanych płytek WT, które wykazywały silną adhezję do lamininy, adhezja płytek z niedoborem CalDAG-GEFl stymulowanych oby- dwoma agonistami była znacząco hamowana. Zależność procesu adhezji od integryny a | 3A wykazano przez blokowanie tego receptora na płytkach WT (Figura 6A). Przy tym samym ustawieniu eksperymentalnym przetestowaliśmy także adhezję płytek z niedoborem CalDAG-GEFI do fibronektyny, w procesie pośredniczonym przez integryny a5Pi i a IIbp3 (34, 36). Ponieważ nie jesteśmy świadomi żadnych specyficznych odczynników, które hamują adhezję mysich płytek krwi do fibronektyny za pośrednictwem integryn. IIbp3, w doświadczeniach kontrolnych stosowaliśmy EDTA do hamowania obu integryn. 1. i adhezję pośredniczoną przez 3 integrynę. Swoistość procesu adhezji dla integryn a3 i a1 została zweryfikowana w badaniach z aktywowanymi płytkami krwi pozbawionymi integryn a3, które przylegały do fibronektyny w sposób zależny od integryny a5 pi4 (dane nie przedstawione). Ponownie, płytki z niedoborem CalDAG-GEFI o pobudzonym U46619 / ADP wykazywały znacząco upośledzoną adhezję do fibronektyny (Figura 6B). Nie zaobserwowano znaczącej różnicy w adhezji WT i płytek z niedoborem CalDAG-GEFI . stymulowanych PAR4p, co wskazuje, że lub więcej alternatywnych szlaków sygnałowych pośredniczy w aktywacji integryny. w płytkach pobudzanych przez PAR4. Wyniki te dostarczają mocnych dowodów na to, że CalDAG-GEFI jest ważną cząsteczką sygnałową pośredniczącą w aktywacji integryn APa i A5A1 w płytkach krwi aktywowanych przez niektórych, ale nie wszystkich, agonistów płytek. Figura 6: Upośledzona aktywacja integryn | 3 w płytkach z niedoborem CalDAG-GEFI. (A i B) Biotynylowane płytki krwi WT i CalDAG-GEFl . stymulowano PAR4p (2 mM) lub U46619 / ADP (5 lub 10 (M) w obecności przeciwciała blokującego na AIlbp3 i pozostawiono do przylegania do 30 minut w warunkach statycznych na lamininę (A) lub fibronektynę (B) na płytkach do mikromiareczkowania. Oddzielna grupa płytek WT była wcześniej leczona blokującym przeciwciałem na A6 (adhezja do lamininy) lub EDTA (adhezja do fibronektyny), aby wykazać zależność integryny w procesie adhezji. Przylegające płytki oznaczono ilościowo kolorymetrycznie dla aktywności peroksydazy. Dane są średnie. SEM z 3 indywidualnych doświadczeń w potrójnych dołkach. ** P <0,01, *** P <0,001. Podobne wyniki zaobserwowano dla nie -otynylowanych płytek krwi, gdy liczbę płytek klejących oznaczono za pomocą mikroskopu świetlnego (nie pokazano). CalDAG-GEFI. /. myszy nie tworzą skrzeplin w modelu eksperymentalnej trombozy tętniczej. W celu określenia wpływu wadliwej aktywacji integryny y1 i a3 na powstawanie skrzepu in vivo badano WT i CalDAG-GEFI. /. myszy w modelu wywołanej FeCl3 zakrzepicy tętniczej (37, 38). W tym modelu FeCl3 powoduje denudację śródbłonka prowadzącą do ekspozycji zewnątrzkomórkowej matrycy, co z kolei sprzyja adhezji i aktywacji krążących płytek krwi. Nie zaobserwowaliśmy znaczącej różnicy między WT a CalDAG-GEFI. /. myszy na częstość tethering płytek krwi (Figura 7, A i B). Nie było to zaskakujące, ponieważ początkowe uwięzienie płytek krwi zależy od konstytutywnie aktywnego kompleksu receptora GPIb-V-IX (33), który był wyrażany dużą liczbą kopii zarówno w WT, jak i zmutowanych płytkach krwi (średnia intensywność fluorescencji, CalDAG-GEFI A / 8, 907-37,8, WT, 886,7-35,9). Jednak silna adhezja i / lub agregacja płytek krwi w miejscach uszkodzenia naczyń wymaga agonistycznej, wyładowczej aktywacji integryn płytek krwi. Pierwsze skrzepliny u myszy WT około 10 minut po nałożeniu FeCl3 (dane nie pokazane) i okluzja naczynia obserwowano u wszystkich myszy WT w ciągu 20 minut (średni czas zgryzu, 14 . 1,3 minuty), podczas gdy tworzenie skrzepliny było całkowicie nieobecne u myszy WT. CalDAG-GEFI. /. myszy na czas trwania 40-minutowego okresu obserwacji (Figura 7, A i C). Film wideo przedstawiający adhezję płytek krwi / powstawanie skrzeplin w czasie rzeczywistym w uszkodzonych tętniczkach jest dostarczany jako dane uzupełniające (Supplemental Video 1, dostępny online z tym artykułem; doi: 10.1172 / JCI30575DS1). Tak więc, CalDAG-GEFI jest głównym regulatorem aktywacji integryny ai i p3, a jego brak ma głęboki wpływ na funkcję płytek krwi in vivo. Figura 7 Adhezja płytek i tworzenie skrzeplin w tętniczkach z uszkodzonym FeCl3. (A) WT i CalDAG-GEFI. /. myszom wstrzyknięto płytki krwi znakowane zieloną kalceiną o odpowiednim genotypie, a adhezję płytek monitorowano w tętniczkach krezkowych (średnica, WT, 90,7 . 3,5 um, CalDAG-GEFIa / P, 96,4 <4,0 (im) po podaniu FeCl3. Obrazy pokazują adhezję płytek krwi i powstawanie skrzeplin w tętniczkach we wskazanym czasie po zastosowaniu FeCl3 [podobne: co dziś zjem na śniadanie, emedlink, typy osobowości wg junga ] [patrz też: clotrimazolum ulotka, octenisept ulotka, koszulki ratownictwo medyczne ] [przypisy: clotrimazolum ulotka, octenisept ulotka, koszulki ratownictwo medyczne ]