Myszy nie posiadające cząsteczki sygnalizującej CalDAG-GEFI reprezentują model niedoboru adhezji leukocytów typu III ad 8

W CalDAG-GEFI u myszy, wady przyczepności neutrofili były najbardziej widoczne w warunkach przepływu, ale obserwowano go również w warunkach statycznych. Nasze odkrycie, że CalDAG-GEFI ma kluczowe znaczenie dla aktywacji integryn | 3, | 2, i | 3 w płytkach myszy i neutrofilach sugeruje, że ten gen może być wadliwy u pacjentów z LAD-III. Z powodu defektów w tworzeniu się skrzepu i rekrutacji leukocytów do miejsc zapalenia, myszy z niedoborem CalDAG-GEFI stanowią zwierzęcy model tej choroby. Metody Myszy CalDAG-GEFI. /. (15) i myszy z miotem kontrolnym WT uzyskano z myszy na MIT i hodowano w ośrodku myszy w CBR Institute for Biomedical Research. Itgb3. /. myszy na tle BALB / c były hojnym darem od R. Hynesa (MIT). Procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Pielęgnacji i Użytkowania Zwierząt w CBR Institute for Biomedical Research. Cytometria przepływowa Krew pobierano ze splotu pozagałkowego do heparynizowanych probówek. Jeden mililitr pełnej krwi inkubowano w 10 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (155 mM NH4CI, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,4) przez 10 minut, a następnie odwirowywano przez 8 minut w 185 g. Supernatant odrzucono, a osad ponownie zawieszono w zmodyfikowanym buforze Tyrode (15). Ekspresja receptorów adhezji w spoczynkowych PBL. Komórki spoczynkowe barwiono fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami przez 30 minut w 4 ° C i natychmiast analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Neutrofile zidentyfikowano przez określenie charakterystyki rozproszenia przedniego / bocznego i barwienie specyficznym dla neutrofili przeciwciałem monoklonalnym Gr-1 (BD Biosciences). Ekspresja Mac-1 na spoczynkowych i aktywowanych neutrofilach. PBL utrzymywano w stanie spoczynku lub stymulowano za pomocą 300 nM LTB4, 200 nM PMA lub 50 ng / ml C5a przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Komórki barwiono 2 .g / ml skoniugowanego z FITC anty-Mac-1 (BD Biosciences) i natychmiast analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Pomiary strumienia wapnia w neutrofilach krwi obwodowej. PBL inkubowano z 5 .M wykrywającego wapń barwnika Fluo-3 (Invitrogen) przez 15 minut, przemywano w zmodyfikowanym buforze Tyrode zawierającym mM CaCl2 i mM MgCl2, aktywowano wskazanymi agonistami i analizowano natychmiast metodą FACS. Dane analizowano za pomocą oprogramowania FlowJo (wersja 6.4.3, Tree Star Inc.). Wytwarzanie ROS w neutrofilach. PBL ponownie zawieszono w RPMI i inkubowano z 7,5 jim wykrywającym ROS barwnikiem DCFDA-H2 (Invitrogen) przez 15 minut. Po odwirowaniu znakowanych komórek przy 185 g przez 5 minut nadmiar barwnika odrzucono i komórki ponownie zawieszono w buforze RPMI. PBS, 5 (3M fMLP lub 2. M PMA dodano do PBL obciążonych DCFDA w punkcie czasowym 0. Średnie wartości fluorescencji w kanale (FL1) około 2000 komórek Gr-1 (3-dodatnich oceniano w 5-minutowych odstępach czasu dla do 60 minut. W celu normalizacji indywidualnych eksperymentów wyznaczono stosunek średnich wartości FL1 komórek stymulowanych i niestymulowanych. Aktywacja Rap1 Ilości aktywowanego Rap1 w neutrofilach zmierzono stosując protokół podobny do uprzednio opisanego dla płytek krwi (15). Neutrofile izolowano ze szpiku kostnego WT i CalDAG-GEFI2 /. myszy z zastosowaniem sortowania negatywnego z kolumnami do rozdzielania MACS (Miltenyi Biotec). Po lizie czerwonych komórek komórki szpiku kostnego inkubowano przez 10 minut w temperaturze 4 ° C z 10 .g / ml anty-CD45R, 10 .g / ml anty-CD5, 5 .g / ml anty-CD8 i 5 .g / ml anty-CD4 (wszystkie z BD Biosciences). Po 2 etapach przemywania komórki inkubowano z kulkami anty-szczurzy Ig przez 10 minut w 4 ° C, ponownie przemyto i przepuszczono przez 25 kolumn magnetycznych LD (Miltenyi Biotec). Wyeluowane komórki barwiono przeciwciałem Gr-1, a procent komórek Gr-1 (3-dodatnich oznaczano za pomocą cytometrii przepływowej. Do badań adhezji użyto jedynie próbek zawierających więcej niż 90% komórek Gr-1. Neutrofile (5 x 106) aktywowano przez 30 sekund za pomocą 300 nM LTB4, 75 ng / ml C5a lub 3 lub 30 nM PAF i natychmiast poddano lizie z lodowatym buforem do lizy (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl 1% Nonidet P-40, 5 mM MgCl2, 5% glicerol i kompletny koktajl inhibitora proteazy bez EDTA; Roche Diagnostics). Wykrywanie aktywowanego Rap1 (Rap1-GTP) w lizatach neutrofili przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta (Pierce). Pokrótce, Rap1-GTP (lub Rapl . GTP-P) wytrącono z lizatów, stosując białko fuzyjne GST-RalGDS-RBD. Wytrącone białka rozdzielano na 15% żelu SDS-PAGE i przenoszono na membrany PVDF (Millipore). Rap1 wykryto za pomocą króliczych przeciwciał poliklonalnych, a następnie przeciwciał anty-królika sprzężonych z peroksydazą chrzanową (Vector Laboratories)
[więcej w: street workout plan treningowy, różyczka objawy u dorosłych, badanie psychotechniczne ]
[hasła pokrewne: przeziernosc karkowa, debutir ulotka, microgynon ulotka ]
[patrz też: przeziernosc karkowa, debutir ulotka, microgynon ulotka ]