Myszy nie posiadające cząsteczki sygnalizującej CalDAG-GEFI reprezentują model niedoboru adhezji leukocytów typu III ad 9

Immunoreaktywność wykrywano za pomocą ulepszonej chemiluminescencji Western Lightning (PerkinElmer Life Sciences). W celu określenia poziomu całkowitego Rap1, x 106 WT lub neutrofili z niedoborem CalDAG-GEFI p poddano lizie przy użyciu redukującego buforu do próbek SDS i białka rozdzielono na 15% żelu SDS-PAGE. Rapl wykryto za pomocą króliczych przeciwciał poliklonalnych, jak opisano powyżej. Test adhezji neutrofilów Dziewięćdziesiąt sześć studzienkowych płytek (Costar) powleczono 2 mg / ml fibrynogenu lub 10 ug / ml fibronektyny (obie od Sigma-Aldrich) przez noc i zablokowano 1% BSA przez 2 godziny. Izolowane neutrofile szpiku kostnego (1 x 106 / ml) dodano w obecności lub nieobecności wskazanych agonistów i inkubowano przez 30 minut w 37 ° C. Supernatant odrzucono, płytkę przemyto PBS, a neutrofile przylegające do płytki policzono przy użyciu mikroskopu TMS firmy Nikon. Adherentne granulocyty obojętnochłonne w obszarze zainteresowania zostały zliczone przez 2 osoby oślepione ich źródłem. Alternatywnie, adhezję neutrofilów analizowano przez kwantyfikację aktywności mieloperoksydazy (MPO) w lizacie adherentnych komórek (51). Pokrótce, przylegające neutrofile poddano lizie w buforze fosforanu potasu, zawierającym 0,5% bromku heksadecylotrimetyloamoniowego (HTAB), a aktywność MPO określono przez dodanie tetrametylobenzydyny (TMB) jako substratu. Odczyty OD przeprowadzono w 96-dołkowym czytniku mikropłytek przy długości fali 630 nm. Oznaczanie adhezji płytek krwi W badaniach przyczepności płytek krwi 96-studzienkowe płytki (Nunc) powlekano przez noc w 4 ° C lamininą lub fibronektyną (obie z Sigma-Aldrich) w stężeniu 4 ug / ml, a następnie inkubowano z PBS plus 5 % BSA przez 2 godziny w 37 ° C. Osocze bogate w płytki (PRP) otrzymano z heparynizowanej krwi pełnej przez odwirowanie przy 100 g przez 10 minut, a następnie odwirowano przy 700 g w obecności PGI2 (2 ug / ml) przez 7 minut w temperaturze pokojowej. Po 2 etapach przemywania, grudkowane płytki zawieszono ponownie w zmodyfikowanym buforze Tyrode-HEPES. Płytki (2 x 109 / ml) inkubowano z NHS-biotyną (1 mM; Pierce) przez 10 minut, przemyto dwukrotnie i ponownie zawieszono w zmodyfikowanym buforze Tyrode zawierającym Ca2 + i Mg2 + (po mM każdy). Komórki pozostawiono niestymulowane lub aktywowano 2 mM PAR4p lub 5 lub 10