Myszy nie posiadające cząsteczki sygnalizującej CalDAG-GEFI reprezentują model niedoboru adhezji leukocytów typu III cd

Po stymulacji LTB4, C5a lub niskiej dawce czynnika aktywującego płytki krwi (PAF, 3 nM), zaobserwowano silny wzrost Rap1-GTP w lizatach z WT, ale nie z neutrofilami z niedoborem CalDAG-GEFlp (Figura 2). Defekt indukowanej przez PAF aktywacji Rap1 obserwowanej w neutrofilach z niedoborem CalDAG-GEFIp został częściowo przezwyciężony poprzez zwiększenie stężenia agonisty do 30 nM. Co więcej, wytraciliśmy Rap1-GTP z lizatów preinkubowanych z GTP-P, formą GTP, która nie może być hydrolizowana do GDP przez wewnętrzną aktywność GTPazy Rap1. Wykryliśmy równoważne poziomy GTP-yS1 załadowanego Rap1 w próbkach mutanta i WT, wykazując, że Rap1 z neutrofili CalDAG-GEFI. /. myszy nie miały wewnętrznej defektu aktywacyjnego. Poziomy całkowitego Rap1 były porównywalne w lizatach całych komórek z WT i neutrofili z niedoborem CalDAG-GEFI3 (Figura 2). Łącznie, te dane pokazują, że CalDAG-GEFI odgrywa ważną rolę w aktywacji Rap1 w neutrofilach stymulowanych przez różnych agonistów i że defekt w aktywacji Rap1 obserwowany w neutrofilach z niedoborem CalDAG-GEFI . można przezwyciężyć przez zwiększenie stężenia agonisty. Figura 2 Zwalczona aktywacja Rap1 w neutrofilach z niedoborem CalDAG-GEFI. Western blot z wyznakowanym powinowactwem Rap1-GTP wykazującym silnie zmniejszoną aktywację Rap1 w neutrofilach z niedoborem CalDAG-GEFIp (a / p) stymulowanych LTB4 (300 nM przez 30 sekund), C5a (75 ng / ml przez 30 sekund) lub PAF (3 lub 30 nM przez 30 sekund) w stosunku do neutrofilów WT (+ / +). Ekwiwalentne obciążenie GTP na Rap1 w neutrofilach z WT i CalDAG-GEFI. /. u myszy wykazano przez wstępną inkubację lizatów z GTP-P. Całkowite poziomy Rap1 określono w lizatach całych komórek z neutrofilami WT i kaldagenem GLDAG-GEFl. Wyniki są reprezentatywne dla 3 indywidualnych eksperymentów. Upośledzona aktywacja integryn | 3 i a2 w neutrofilach z niedoborem kalcGG-GEFI w warunkach in vitro. Aby określić, czy niedobór CalDAG-GEFI wpływał również na aktywację integryn w neutrofilach, najpierw badano adhezję mediowanej integryną p1 z izolowanymi neutrofilami z niedoborem CalDAG-GEFI . do fibronektyny. Neutrofile izolowane ze szpiku kostnego WT i CalDAG-GEFI. /. myszy aktywowano za pomocą 300 nM LTB4 i monitorowano adhezję do płytek powleczonych fibronektyną. Jak pokazano na Figurze 3A, adhezja neutrofili z niedoborem CalDAG-GEFlp była znacznie upośledzona w porównaniu z neutrofilami WT. Następnie badano. Adhezję z udziałem integryn. 2 z fibrynogenem, jak wykazano wcześniej, że w wiązaniu leukocytów z tym ligandem pośredniczą receptory integryny. 2. M. 2 (Mac-1) i A X. 2 (25). W porównaniu z neutrofilami WT, neutrofile z niedoborem CalDAG-GEFlp aktywowane za pomocą LTB4 lub PAF wykazywały upośledzoną adhezję do fibrynogenu (Figura 3B). Figura 3 Niedobór CalDAG-GEFI powoduje zaburzenia integryny y1. i adeptinę adhezji neutrofilów za pośrednictwem integryny y2 in vitro. (A i B) Adhezja neutrofilów do fibronektyny (A) lub fibrynogenu (B) in vitro. Wzdłużne neutrofile WT lub CalDAG-GEFIp wyizolowane ze szpiku kostnego dodano do płytek powleczonych fibronektyną lub fibrynoge- nem i inkubowano przez 30 minut w obecności lub nieobecności (tj. W stanie spoczynku) 300 nM LTB4 lub 3 lub 30 nM PAF. Płytki przemyto i policzono przylegające neutrofile. n = 4. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001. CalDAG-GEFI ma kluczowe znaczenie dla silnej adhezji neutrofili pośredniczonej przez p 2 integryną in vivo. Następnie zbadaliśmy adhezję leukocytów do aktywowanych żylaków krezkowych w CalDAG-GEFI. /. i myszy WT. Venules poddawano superfuzji za pomocą 300 nM LTB4 w PBS, i zrolowano, a także mocno przylegające leukocyty znakowane rhodaminą 6Gs zliczano w ciągu 20 minut. Istotnie więcej toczących się leukocytów zaobserwowano w CalDAG-GEFI . /. niż u myszy WT (P <0,04, Figura 4A). Jednakże może to nie być wynikiem zwiększonej przyczepności zmutowanych komórek, ale raczej około 2-krotnie większej liczby obwodowych neutrofili krążących u tych zwierząt (15). Nie jest zaskakujące, że leukocyty z niedoborem CalDAG-GEFI . walcowały normalnie wzdłuż stymulowanych żyłek, ponieważ proces ten zależy w dużym stopniu od wiązania PSGL-1 leukocytarnego do selekcji śródbłonka (26), a PSGL-1 jest konstytutywnie aktywnym receptorem, który odkryliśmy dla wyrażać normalnie w CalDAG-GEFI. /. myszy (tabela 1). Przeciwnie, silna adhezja leukocytów indukowana przez LTB4 wymaga szybkiej aktywacji integryn (27, 28) przez wewnątrzkomórkowe ścieżki sygnałowe. Stwierdziliśmy, że leukocyty WT silnie przylegały do żylaków krezkowych w ciągu kilku minut od superfuzji LTB4, podczas gdy silna adhezja leukocytów z niedoborem CalDAG-GEFl . była zmniejszona o ponad 90% (Figura 4B). [patrz też: czy kawa podnosi ciśnienie, jaskółcze ziele zastosowanie, kalafior wartości odżywcze ] [patrz też: koszulki ratownik medyczny, twardzina układowa objawy, vegantalgin ] [hasła pokrewne: koszulki ratownik medyczny, twardzina układowa objawy, vegantalgin ]