Niedotlenienie indukuje funkcjonalnie istotny i translacyjnie skuteczny wariant mRNA neuronalnej syntazy NO ad 10

Trzy zachodzące na siebie klony P1 odwzorowano metodą częściowego trawienia enzymatycznego przy użyciu EcoRI, MluI, SalI i Smal w systemie mapowania CHEF-DR III (Bio-Rad Laboratories). Southern bloty hybrydyzowano ze znakowanymi [a-32P] znakowanymi ATP . starterami T7 i Sp6 i starterami specyficznymi dla eksonu 2. DNA PI o dużej masie cząsteczkowej częściowo strawiono Sau3AI, subklonowano do miejsca BamHI pBluescript SK (.), I poddany analizie sekwencji DNA. Sekwencję genomowego DNA określono na obu niciach genomowego DNA za pomocą zautomatyzowanego sekwenatora DNA ABI PRISM 377 (Applied Biosystems). Myszy transgeniczne nNOS / LacZ. Transgeniczną linię myszy nNOS / LacZ wytworzono w hybrydowym szczepie myszy C57BL6 / SJL, za pośrednictwem Narodowego Instytutu Zdrowia Dziecka i Rozwoju Ludzkiego Transgenicznego Ośrodka Rozwoju Myszy, University of Alabama, z użyciem technik opisanych uprzednio (20, 69). Myszy te eksprymowały gen reporterowy E. coli LacZ ((3-galaktozydazy) pod kontrolą transkrypcyjną ludzkich regionów genomowych nNOS obejmujących. 2,453 do. 77 ponumerowanych w odniesieniu do początkowego miejsca translacji (numer dostępu GenBank U17299, Figura 6A). Ten region genomowy zawiera 418 nt sekwencji zawartych w 5a -UTR wcześniej opisanych ludzkich cDNA nNOS, które odpowiadają regionom eksonowym cDNA, o których wiadomo, że zawierają różne sekwencje liderowe eksonu (23). Gen reporterowy LacZ (P-galaktozydaza) zawierał duży sygnał jądrowy lokalizacji SV40 (5a-GGGCCCAAGAAGAAACGCAAAGTGGGGAG-3y) i eukariotyczny sygnał inicjacji translacji. Fragment Hindlll o długości 516 par zasad odpowiadający regionom genomowym 3 (3 -UTR i flokulacji . genu ludzkiej .-globiny został włączony na końcu 3a w ORF LacZ w celu zapewnienia prawidłowego przetwarzania RNA (20, 69). Ogonowe genomowe DNA wyizolowano w momencie odsadzania, a genotypowanie przeprowadzono za pomocą zmodyfikowanego Southern-blot, jak opisano wcześniej (69). Od 8 oryginalnych założycieli F0, 5 linii założycielskich transmitowało transgen do potomstwa F1 i wykazywało normalną odziedziczalność Mendla. W obecnym badaniu wykorzystano i scharakteryzowano transgeniczną linię myszy nNOS ekson 2 promotor / LacZ reporter . i uprzednio ustalony i scharakteryzowany mysi promotor eNOS / transgeniczna linia myszy reporterowa LacZ (69). Obie transgeniczne linie myszy eksponowano na niedobór normobaryczny (FiO2 = 0,08) lub normoksję przez 48 godzin, a następnie poddano eutanazji ketaminą / ksylazyną (odpowiednio 200 i 10 mg / kg, dootrzewnowo). Serce, płuca, nerki, mózg i aortę wycięto, podzielono na sekcje (sekcje 0,25 cm) i umieszczono w buforze utrwalającym (2% formalina, 0,2% glutaraldehyd, 5 mmol / l EGTA, 2 mmol / l MgCl2, 0,1 mol / l bufor fosforanu sodu, pH 7,3) przez 4. 6 godzin. Naprawiono tkanki zatopiono w parafinie, pocięto na 10-.m przekroje, wybarwiono na P-galaktozydazę i barwiono kontrastowo czerwienią jądrową, jak opisano wcześniej (69). Slajdy wizualizowano za pomocą mikroskopu pionowego Leica Microsystems Canada Inc. Leica DM, a obrazy rejestrowano przy użyciu aparatu CoolSnap i dołączonego oprogramowania (wersja 1.2.0; Roper Scientific Inc.). RT-PCR w czasie rzeczywistym. Wszystkie ilościową analizę PCR przeprowadzono przy użyciu ABI PRISM 7900 HT (Applied Biosystems) z zastosowaniem systemu detekcji SYBR Green. Jakość całkowitego komórkowego RNA oceniano za pomocą Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). C-RNA pierwszej nici syntetyzowano z całkowitym komórkowym RNA (1 – 5 (5 g) pochodzącym z różnych mysich tkanek (nerka, aorta i krezkowe naczynia krwionośne) przy użyciu losowych starterów i odwrotnej transkryptazy SuperScript II (Life Technologies, Invitrogen Corp.). Reakcje przeprowadzono w trzech powtórzeniach na pulach cDNA zsyntetyzowanych z doświadczeń przeprowadzonych w 3 niezależnych liniach założycielskich zawierających cDNA równoważne 100 ng RNA z odwrotną transkrypcją. W celu ilościowego oznaczenia liczby kopii użyliśmy seryjnych 10-krotnych rozcieńczeń plazmidów odpowiadających docelowym RNA w celu wygenerowania standardowych krzywych. W celu ilościowego oznaczania nNOS w tkankach mysich, startery obejmowały wspólny region (ekson 8/9): mysi sens NNOS 5. -TGGGCGATCCAGCTAATGTGG-3 ., mysi antysensowny 5. -GGGGATGGAAAGAGTTCAGGGTC-3 .. W celu kwantyfikacji reporterowych RNA w mysich myszach reporterowych promotora .-galaktozydazy (LacZ) promotora nNOS, para primerów w czasie rzeczywistym przekroczyła intron znajdujący się w obrębie ludzkiej .-globiny 3a -UTR i flankujące sekwencje genomowe stosowane do pierwotnego przetwarzania transkryptu: reporter LacZ / y – sens globiny 5a-ACCCGGTCAACTTCAAGCTCC-3 (3, reporter LacZ / y – globina antysensowny 5a-GGTGCTCACAGAAGCCAGGAA-3 .. Zastosowano następujące geny i startery utrzymujące porządek: mysi sens Gapdha 5 (3 -TTCACCACCATGGAGAAGG-3; mysi antysensowny Gapdh 5a-CTCGTGGTTCACACCCATC-3; Sens 18S 5 -AGGAATTGACGGAAGGGCAC-3 3; 18S antysensowny 5 (3-GGACATCTAAGGGCATCACA-3a; mysie znaczenie Hprt 5a-AAACAATGCAAACTTTGCTTTCC-3; mysie Hprt antysensowne 5a-AGCTTGCTGGTGAAAAGGACC-3 .. Generowanie konstrukcji reporterów
[hasła pokrewne: tabliczka mnożenia na czas, zdrowa żywność zdrowy styl życia, rehabilitacja po zerwaniu ścięgna achillesa ]
[przypisy: dicortineff ulotka, ibum forte ulotka, szpital dziecięcy lublin chodźki ]
[więcej w: dicortineff ulotka, ibum forte ulotka, szpital dziecięcy lublin chodźki ]