Niedotlenienie indukuje funkcjonalnie istotny i translacyjnie skuteczny wariant mRNA neuronalnej syntazy NO ad 11

Testy translacyjne przeprowadzono z użyciem RNA zamiast transfekcji DNA w celu wyeliminowania czynników związanych z regulacją transkrypcji. Seria wektorów ekspresyjnych RNA in vitro została skonstruowana przy użyciu zmodyfikowanego plazmidu pSP-Luc + (Promega), który zawierał sekwencję 60 reszt adenylanowych 3. ORF lucyferazy, jak opisano wcześniej (23, 29). Białko lucyferazy kodowane przez ORF było identyczne we wszystkich konstruktach, aby wyeliminować różnice wynikające z różnic w stabilności białka. Kompletna część 5 -UTR eksonu 2 z ludzkiego nNOS została umieszczona powyżej ORF lucyferazy. Ten konstrukt, nazwany Ex2-Long, posiadał 5 -UTR 405 nt. Konstrukt Ex2-Long został skrócony przez natywne miejsce BamHI w celu wygenerowania konstruktu reportera Ex2-Short, który następnie zawierał 77 nt sekwencji 5 -UTR. Do celów porównawczych dodano uprzednio opisany reporter zawierający (29) reporter Ex-1c. Konstrukt ten zawierał 326 nt sekwencji Ex-1c (numer dostępu w GenBanku AF049714), a następnie kompletną część 5 -UTR eksonu 2, tym samym posiadającą 831 nt sekwencji 5 pUTr. W poprzednich badaniach i obecnych pracach stwierdzono, że stabilność tych konstruktów mRNA pozostaje niezmieniona przez zmianę sekwencji 5 (3 -UTR (23, 29). Aby ocenić możliwą obecność IRES (70) w 5 (3 -UTR ludzkiego mNNA nNOS indukowalnego przez hipoksję, wygenerowano bicistronowe plazmidy w celu porównania wydajności translacji transkryptu zawierającego tę sekwencję lub nukleotydów egzonowych nNOS-ji z mRNA zawierającego dobrze scharakteryzowany IRES (71). Plazmidy pRF i pRhrvF, które zawierają ludzki rinowirus IRES, były dobrymi prezentami od A. Willisa (University of Leicester, Leicester, Wielka Brytania) i zostały wcześniej opisane (72). Aby utworzyć bicistronowe plazmidy pREx2F, pREx1cF i pREx1gF, sekwencje cDNA nNOS zawierające nieulegający translacji region eksonu 2 i wariant Ex-1c lub Ex-1g wstawiono do miejsca wielokrotnego klonowania wektora pRF. Aby utworzyć konstrukt pRpolioF, cDNA kodujący element IRES wirusa polio (miły prezent od J. Pelletier, McGill University) został wstawiony do wektora pRF. Transfekcje RNA. Komórki C2C12 [mysi szkieletowy mioblast, nNOS (+); ATCC] hodowano w DMEM uzupełnionym 15% FBS i antybiotykami. Komórki PC12 [pheochromocytoma szczura, nNOS (+); ATCC] utrzymywano w RPMI uzupełnionym 10% inaktywowaną termicznie surowicą końską, 5% FBS i antybiotykami (Gibco, Invitrogen Corp.). Komórki CHO-K1 [nNOS (+); ATCC] hodowano w DMEM uzupełnionym 10% FBS i antybiotykami. Transkrypcję w warunkach in vitro zamkniętego RNA przeprowadzono stosując zestaw SpM i T7 mMessageMachine (Ambion Inc.). Jakość zsyntetyzowanego in vitro, 7mGpppG RNA oszacowano na 0,66 M żelu agarozowego formaldehydu-1%. Komórki utrzymywano na 60-milimetrowych płytkach i transfekowano przy 50. 70% zlewności z syntetyzowanym, ilościowo, zrębkowanym RNA in vitro, stosując Lipof
[przypisy: jaskółcze ziele zastosowanie, twardzina układowa objawy, dieta przy dnie moczanowej tabela ]
[podobne: emedlink, koszulki ratownik medyczny, twardzina układowa objawy ]
[hasła pokrewne: emedlink, koszulki ratownik medyczny, twardzina układowa objawy ]