Niedotlenienie indukuje funkcjonalnie istotny i translacyjnie skuteczny wariant mRNA neuronalnej syntazy NO ad 8

Szpital Michaela. Jak opisano wcześniej (14), samce szczurów Sprague-Dawley (200. 250 g; Charles River Laboratories) umieszczono w komorze z pleksiglasu (30 x 18 x 15 cm), do których przepływ powietrza i azotu kontrolowano niezależnie przez 48 godzin. , a następnie poświęcony przez dekapitację. Zwierzęta narażone na niedotlenienie wdychały mieszaninę zawierającą 8% tlenu, podczas gdy zwierzęta kontrolne oddychały powietrzem pokojowym tylko w tych samych warunkach. W jednym zestawie eksperymentów, aorty piersiowej od szczurów normoksycznych i szczurów wystawionych na niedotlenienie były podzielone na pół, a połowę każdej aorty pozbawiono śródbłonka przez delikatne ścieranie powierzchni światła przed podzieleniem na 4-mm pierścienie. Segmenty równoważono w napowietrzonym roztworze Krebsa-Henseleita (w mmol / l: 120 NaCl, 25 NaHCO3, 11,1 glukozy, 4,76 KCl, 1,18 MgSO4, 1,18 KH2PO4 i 2,5 CaCl2) przez godzinę w 37 ° C pod napięciem spoczynkowym 2 sol. Niepowodzenie acetylocholiny (Ach; 10 .moli / l) wywołujące relaksację po skurczeniu z PE (1 .mol / l) przyjęto jako dowód funkcjonalnej ablacji śródbłonka. PE i Ach zostały następnie wypłukane i pozwolono, aby napięcie powróciło do 2 g. Relacje stężenie-odpowiedź dla PE (1 nmol / l do 10 umol / l) w pierścieniach nienaruszonych i nienasyconych w śródbłonku lub chlorku potasu (KCl; 0 ~ 50 mmol / l) w pierścieniach z pierścieniem denaturowanym następnie wytworzono w obecności i nieobecne L-NAME (10. mol / l). Pod koniec każdego doświadczenia, pierścienie wysuszono przez noc i zważono tak, aby skurcz mógł być wyrażony wg / mg suchej masy. W drugiej serii eksperymentów oporność na tętniczki z krążenia krezkowego (o średnicy <100 - 200. M) od szczurów normoksycznych i szczurów poddanych działaniu hipoksji wycięto, a śródbłonek usunięto przez delikatne ścieranie. Następnie tętnice krezkowe pocięto na 2-mm segmenty i zamontowano w drucianym myografie (zakupionym od University of Vermont) do pomiaru napięć izometrycznych. Zastosowano napięcie spoczynkowe 200 mg, a naczynia równoważono w roztworze Krebsa-Henseleita przez godzinę w 37 ° C. Usunięcie śródbłonka weryfikowano przez brak odpowiedzi relaksacyjnej na mol / l Ach po wstępnym wstępnym przeprowadzeniu z PE (1 .Mol / l). Następnie PE i Ach wypłukano i pozwolono, aby napięcie powróciło do 200 mg. Zależności stężeń-odpowiedź dla PE (10 nmol / l do 10 .mol / l) skonstruowano następnie w obecności lub nieobecności L-NAME (10 | mol / l). Aortalna aktywność NOS. Koronkę aortalną od szczurów normoksycznych i szczurów eksponowanych na niedotlenienie przez 16 lub 48 godzin wycięto i podzielono na pół, a śródbłonek usunięto z połowy, jak opisano powyżej. Aorty były homogenizowane w lodowatej 50 mmol / l Tris-buforowanej soli fizjologicznej uzupełnionej EDTA (1 mmol / l) i EGTA (1 mmol / l). Próbki odwirowano przy 14 000 g, a zawartość białka w supernatantach oznaczono ilościowo metodą Bradforda (Bio-Rad Laboratories). Aktywność NOS w obecności i nieobecności CaCl2 (0,6 mmol / l) zmierzono przy użyciu zestawu NOSdetect Assay Kit ze Stratagene. W skrócie, 50. 100. G homogenatu (10. L) dodano do mieszaniny reakcyjnej składającej się z Tris-HCl (25 mmol / l, pH 7,4), BH4 (3. Mol / l), dinukleotydu flawonadeninowego (1. mol / l), mononukleotyd flawiny (1 mol / l), NADPH (1 mmol / l), [3H] -L-argininy (0,2 Ci Ci / Al, Amersham Biosciences) i kalmoduliny (0,1 molmola / l) . Po 1-godzinnej inkubacji w 37 ° C reakcję zakończono buforem HEPES (50 mmol / l, pH 5,5) zawierającym EDTA (5 mmol / l). Mieszaninę przesączono przez żywicę Dowex i radioaktywność odpowiadającą [3H] -L-cytruliny zmierzono w 100 .l eluatu za pomocą ciekłego scyntylacji. Dla każdej próbki oznaczano również wytwarzanie [3H] -L-cytruliny w obecności L-NAME (1 mmol / l). Ta wartość została użyta jako kontrola, aby odjąć wszystkie obecne konwersje L-argininy pochodzące od non-NOS. We wszystkich doświadczeniach trzykrotne pomiary dla każdej próbki uśredniono i traktowano jako pojedynczą obserwację. Western blotting. Koronę aorty płucnej, tętniczki krezkowe, tętnice płucne, przepony i mózgi pierwszego rzędu wycięto ze szczurów normoksycznych i szczurów eksponowanych na niedotlenienie przez 48 godzin, a białka ekstrahowano w 1% SDS, mmol / l Na3VO4 i 10 mmol / l. Tris (pH 7,4) z koktajlem inhibitora proteinazy (Sigma-Aldrich). Aby potwierdzić, że ludzka ekspresja nNOS była również regulowana przez tlen i aby rozwiązać bezpośredni wpływ niedotlenienia in vitro, poziomy białka nNOS mierzono w HASMC po noroksycznej i hipoksycznej inkubacji. HASMCs pochodziły z Clonetics i utrzymywane zgodnie z opisem (68). W pasażu 6, po osiągnięciu 80% konfluencji, komórki eksponowano na mieszaninę hipoksyczną (1% O2, 5% CO2, 94% N2) lub normoksyczną (21% O2, 5% CO2, 74% N2) przez 48 godzin. godziny [patrz też: produkty o niskim indeksie glikemicznym wykaz, koszulka ratownictwo medyczne, malowanie włosów w ciąży ] [przypisy: koszulka ratownictwo medyczne, jaskółcze ziele zastosowanie, aulin ulotka ] [podobne: koszulka ratownictwo medyczne, jaskółcze ziele zastosowanie, aulin ulotka ]