Niedotlenienie indukuje funkcjonalnie istotny i translacyjnie skuteczny wariant mRNA neuronalnej syntazy NO ad 9

Białka ekstrahowano w buforze do ekstrakcji, jak opisano powyżej i oznaczano ilościowo metodą Bradforda. Białka z aorty piersiowej, tętniczki krezkowe, tętnice płucne, przepony i mózgi ze szczurów eksponowanych na normoksyczne i niedotlenienie i z HASMCS rozdzielano na żelu SDS-poliakryloamidowym o gęstości 4. 12%, przenoszono na nitrocelulozę lub PVDF i sondowano przy użyciu nNOS-u. swoiste monoklonalne lub poliklonalne przeciwciało (BD Biosciences). Białka aortalne od szczurów eksponowanych na normoksyczne i niedotlenione komórki również inkubowano z monoklonalnym przeciwciałem specyficznym dla iNOS (BD Biosciences. Transduction Laboratories). Immunobloty badano za pomocą sprzężonego z HRP osła anty-króliczego IgG (Amersham Biosciences) lub połączonego z HRP kozim anty-mysim IgG (Sigma-Aldrich). Immunoreaktywne prążki wykrywano przez wzmocnioną chemiluminescencję (Amersham Biosciences) i określano ilościowo przez densytometrię przy użyciu skanera Hewlett-Packard i oprogramowania Molecular Analyst (Bio-Rad Laboratories). Sprawność ładowania i przenoszenia białka sprawdzono metodą densytometrii pełnopasmowej membran zabarwionych czerwonym Ponceau. Immunohistochemia. Koronkę piersiową szczurów eksponowanych na normoksję lub niedotlenienie przez 48 godzin utrwalono w 4% paraformaldehydzie i zatopiono w parafinie. Skrawki analizowano za pomocą immunohistochemii pośredniej, stosując przeciwciało poliklonalne do epitopu na końcu karboksylowym białka nNOS (BD Biosciences . Transduction Laboratories) i znakowane HRP przeciwciało drugorzędowe z królika (Amersham Biosciences). Diaminobenzydynę zastosowano jako substrat dla HRP, a tkanki wybarwiono kontrastowo H & E. Szkiełka przetwarzane w identyczny sposób, z wyjątkiem pominięcia pierwotnego przeciwciała, które służyło jako kontrola negatywna. Hybrydyzacja in situ. Aorty od szczurów eksponowanych na normoksję lub niedotlenienie przez 48 godzin utrwalono w 4% paraformaldehydzie i podzielono. Hybrydyzację in situ przeprowadzono na tych skrawkach tkanki, jak opisano wcześniej (16, 68) przy użyciu znakowanej [35S] antysensownej rybosfery komplementarnej do eksonu 2 mRNA nNOS o pełnej długości (numer dostępu w GenBank NM 052799). Skrawki tkanek permeabilizowano Tritonem X-100 i proteinazą K i potraktowano bezwodnikiem octowym i trietanoloaminą i kolejnym roztworem N-etyloimaleimidu i jodoacetamidu. Fragmenty tkanki inkubowano przez noc ze znakowaną izotopowo sondą w 42 ° C, traktowano RNazą A, przemywano 2×2 do 0,1 soli fizjologicznej cytrynianem sodu w 22 ° C do 55 ° C, a następnie przetwarzano do autoradiografii. [35S] -znakowany sensowną rybosondę zastosowano jako kontrolę negatywną. Szybka amplifikacja końców cDNA (5 -RACE). Chcieliśmy scharakteryzować transkrypt (y) mRNA, których ekspresja jest stymulowana przez niedotlenienie przez identyfikację tych wzbogaconych w HASMC po 48 godzinach niedotlenionej inkubacji w porównaniu z komórkami hodowanymi w warunkach normoksycznych (patrz powyżej) z zastosowaniem metody 5a-ARCE. Starter specyficzny dla genu był zlokalizowany w regionie kodującym ekson 2, umożliwiając w ten sposób izolację ludzkich sekwencji cDNA nNOS powyżej eksonu 2. Całkowity komórkowy RNA (1 .g) pochodzący z HASMC inkubowanych w warunkach normalnych i niedotlenionych przez 48 godzin był odwrócony. transkrybowane specyficznym dla genu antysensownym starterem P1 (ekson 2, 5a -CCATGGTAACTAGCTTCC-3a) z zastosowaniem odwrotnej transkryptazy SuperScript II (Life Technologies, Invitrogen Corp.). Do usunięcia matrycy RNA zastosowano RNazę H, a produkt pierwszej nici cDNA ogonowano z dATP przez końcową transferazę deoksynukleotydową, jak opisano poprzednio (24). Przeprowadzono pierwszą rundę PCR przez 35 cykli z przyłączaniem primerów w 55 ° C (generyczne sensowne primery 5a-GACTCGAGTCGACGAATTCAAT-3y, 2,5 pmola i 5 (3-GACTCGAGTCGACGAATTCAA-3a, 25 pmol, specyficzny dla genu antysensowny starter P2, ekson 2, 5a-TCTCTAAGGAAGTGATGGTTG-3 8, 25 pmol). Drugą rundę amplifikacji przeprowadzono przez 35 cykli z przyłączaniem primerów w 57 ° C (ogólny primer sensowny 5a-GACTCGAGTCGACGAATTCAA-3a, 25 pmol, zagnieżdżony antysensowny primer P3, ekson 2, 5a-GGCTGTGTCTAGAAGTGACG-3. , 25 pmol). Produkty PCR trawiono EcoRI / Xbal, subklonowano do pBluescript SK (a) i poddawano analizie sekwencji DNA. Przeprowadzono również niezależną serię 5-RRACE ze starterami umiejscowionymi poniżej opisanego zestawu primerów przy użyciu podobnego podejścia (ekson 2, 5 (3-GTACCTCCAGGGCGCTGT-3 (3 i 5 (3 -CCATGGTAACTAGCTTCC-3 (3). Charakterystyka genomowa. Klony P1 izolowano za pomocą przesiewowego testu PCR z biblioteki diploidalnego DNA genomowego częściowo trawionego Sau3AI w wektorze pAD10SacBII (Genome Systems). Dwie pary genomowych starterów PCR użyto do badań przesiewowych (para primerów 1, Ex-1f sens: 5. -CCTGCGTGGCTACTACATTC-3., Ex-1f antysensowna: 5. -AGACGTCGCAACCCTCATTA-3 ., para primerów 2, sens Ex-1c: 5. -GACTGCCTGACTGCCCTTGT-3 ., Ex antysensowny 1: 5. -CCCCCTCTCAGACAGTGCTC-3.)
[przypisy: emedlink, produkty o niskim indeksie glikemicznym wykaz, objawy głodu alkoholowego ]
[hasła pokrewne: przeziernosc karkowa, debutir ulotka, microgynon ulotka ]
[patrz też: przeziernosc karkowa, debutir ulotka, microgynon ulotka ]