Niedotlenienie indukuje funkcjonalnie istotny i translacyjnie skuteczny wariant mRNA neuronalnej syntazy NO cd

Analiza Western blot wykazała podwyższone poziomy białka nNOS w aortach, tętniczki krezkowe, tętnice płucne, przepony i mózgi od szczurów narażonych na niedotlenienie, w porównaniu z normoksycznymi Zwierząt. Poziomy białka nNOS były również zwiększone w ludzkich aortalnych SMC (HASMC) (Figura 4F) po inkubacji hipoksycznej. Białko iNOS nie zostało wykryte w homogenatach aortalnych szczurów narażonych na normoksyczność lub niedotlenienie (dane nie przedstawione). Figura 4nNOS Western blot przeprowadzane na białkach z aorty (A, n = 5 na grupę), tętniczek krezkowych (B, n = 6 na grupę), tętnic płucnych (C; n = 6 na grupę), przepony (D; n = 6 na grupę) i mózgów (E; n = 5 na grupę) od szczurów normoksycznych (białe słupki, N) i od szczurów narażonych na niedotlenienie 16 (szare słupki, 16H) i 48 (czarne słupki, 48H) godzin oraz od HASMC inkubowano w warunkach normalnych i niedotlenionych przez 48 godzin (F; n = 4 na stan). * P <0,05 dla różnicy od normoksycznej wartości kontrolnej. Immunohistochemia. Tarczka szczurów eksponowana na niedotlenienie przez 48 godzin wykazywała dodatnie wybarwienie białka nNOS w pożywce tunica i warstwach przydanki (Figura 5). Immunoreaktywność nNOS nie została wykryta w pożywce tunicznej aort ze szczurów normoksycznych. Figura 5 Immunohistochemia dla nNOS na skrawkach aorty od szczurów normoksycznych i szczurów wystawionych na niedotlenienie przez 48 godzin. Hybrydyzacja in situ. mRNA nNOS wykryto w przyśrodkowych i przydanych warstwach aorty od normoksycznych i niedotlenionych szczurów; jednakże ziarna reprezentujące transkrypty mRNA nNOS były bardziej obfite w ośrodkach aorty w grupie narażonej na hipoksję niż w grupie normoksycznej, w których transkrypty nNOS były rzadko wykrywane (dane nie przedstawione). Równoległe badania z użyciem oznaczonej [35S] sondy cRNA w orientacji sensownej (kontrola negatywna) nie dawały żadnego sygnału (dane nie pokazane). Klonowanie nowego ludzkiego promotora nNOS. My i inni opisaliśmy rozległe zróżnicowanie 5 (3-mRNA dla mRNA nNOS (21, 23, 28). Ważnym mechanizmem leżącym u podstaw tej różnorodności było alternatywne zastosowanie różnych promotorów. W związku z tym wykorzystaliśmy metodę 5. -Promotowej amplifikacji końców cDNA (5. -RACE) i RNA wyizolowanego z normoksycznych i niedotlenionych HASMC w celu scharakteryzowania struktury mNNA 5. NNOS. terminy wyrażane w niedotlenionych komórkach ludzkich. Projekt RACE pozwalał na klonowanie różnych sekwencji 5y powyżej regionu w eksonie 2, w którym rozpoczyna się translacja nNOS. Łącznie 30 klonów 5. -RACE analizowano z komórek niedotlenionych. Wszystkie klony wykazywały wspólną 5 -sekwencję różniącą się od sekwencji mNNA nNOS uprzednio wykrytych w ludzkich tkankach (23). W naszych wcześniejszych badaniach nie udało się zidentyfikować odpowiednich klonów cDNA (ponad 100 klonów analizowanych w ludzkim mózgu, jądrach, mięśniach szkieletowych, nerkach, sercu i mięśniach szkieletowych). W sumie z dwunastu klonów 5A-RACE analizowano HNMC o normalnym stężeniu. Analizy sekwencji tych klonów, które były bardzo rzadkie, odpowiadają sekwencjom identycznym z poprzednio zidentyfikowanym eksonem 1c (Ex-1c) (23). Charakterystyka klonów bakteriofagowych P1 reprezentujących regiony genomowe odpowiadające ludzkiemu genowi nNOS wskazała, że te unikalne cDNA 5. końce były przylegające do regionów genomowych kodujących ekson 2 obserwowanych w wcześniej opisanych ludzkich cDNA. Ponieważ kodony stop są widoczne we wszystkich 3 ramkach odczytu translacji bezpośrednio przed inicjującym AUG w eksonie 2, inicjacja transkrypcji w tym regionie genomowym nie wpłynie na kodowaną sekwencję białka. W przypadku cDNA pochodzących z tego regionu genomowego transkrypcja inicjuje zatem w obrębie regionów genomowych, które reprezentują 3 a-miejsca intronu lub eksonu 2 cDNA nNOS pochodzące z miejsc inicjacji transkrypcji uprzednio zgłoszonych w innych tkankach. Chociaż oznaczenie jako eksonu 2 nie jest poprawne technicznie dla transkryptów mRNA nNOS indukujących hipoksję w VSMC, będzie używane do celów opisowych. Ekspresja konstruktu promotora nNOS. Użyliśmy insercyjnego mysiego transgenicznego podejścia, aby zaadresować funkcjonalne znaczenie in vivo ludzkich genomowych sekwencji nNOS zidentyfikowanych przez scharakteryzowanie niedotlenionych ludzkich VSMC. Regiony genomowe otaczające 5. koniec mRNA zidentyfikowanych w komórkach niedotlenionych zastosowano do kierowania genu reporterowego (Figura 6A). Ekspresja transgenu reportera nNOS / LacZ nie była obserwowana w kontrolnych tkankach kontrolnych z myszy transgen-dodatnich. Reprezentatywne wycinki brodawki nerkowej i mózgu pokazano na Figurze 6B. Jednak ekspozycja na niedotlenienie (frakcja zainspirowanego tlenu [FiO2] = 0,08; 48 godzin) spowodowała znaczące jakościowo (całkowite lub żadne) zwiększenie barwienia (3-galaktozydazy w komórkach nabłonkowych rdzenia nerkowego i neuronów CNS (Figura 6B)
[podobne: badanie psychotechniczne, rehabilitacja po zerwaniu ścięgna achillesa, ibum forte ulotka ]
[podobne: ibum forte ulotka, szpital dziecięcy lublin chodźki, emedlink ]
[patrz też: ibum forte ulotka, szpital dziecięcy lublin chodźki, emedlink ]