Niedotlenienie indukuje funkcjonalnie istotny i translacyjnie skuteczny wariant mRNA neuronalnej syntazy NO czesc 4

Odwrotnie, podstawowa ekspresja reportera a-galaktozydazy u myszy transgenicznych reporterowych eNOS / LacZ . w nerkach i mózgu od myszy normoksycznych została zniesiona u myszy eksponowanych na hipoksję. Wpływ niedotlenienia na ekspresję konstruktu reporterowego nNOS / LacZ i mRNA nNOS w tętniczkach krezkowych, nerkach i aorcie myszy transgen-dodatnich przedstawiono na Figurze 7. Ekspozycja na hipoksję spowodowała znaczny wzrost poziomów tych mRNA we wszystkich 3 tkanki. Figura 6 Wpływ niedotlenienia na myszy transgeniczne promotora nNOS / reportera LacZ. (A) Ogólny schemat insercyjnego konstruktu ekson 2nNOS / transgenicznego reportera LacZ stosowanego do generowania transgenicznej linii myszy. Reprezentatywne sekcje histologiczne przedstawiono dla ekspresji P-galaktozydazy w brodawki nerkowej (powiększenie: x 200) i mózgu (powiększenie: x 250) od myszy reporterowych nNOS / LacZ (B) i eNOS / LacZ (C) wystawionych na działanie normoksji lub niedotlenienia; wskazane powiększenia są przybliżone. Ryc. 7 Skutek niedotlenienia (frakcja inspirowanego tlenu [FiO2] = 0,8, 48 godzin, szare słupki) w porównaniu z normoksją (białe słupki) w ekspresji mRNA konstruktu reporterowego nNOS / LacZ (A) i natywnego mRNA nNOS (B) w tętniczkach krezkowych nerki i aortę myszy transgenicznych pozytywnych dla eNOS / reportera LacZ. Tłumaczenie nNOS. Ludzki gen nNOS charakteryzuje się wieloma promotorami, które wytwarzają liczne i różne mRNA, które różnią się sekwencjami 5 -UTR i które mają znaczny wpływ na ich wydajność translacyjną (23). Długie, złożone i wysoce ustrukturowane 5 -UTR nNOS 5 działają jako przeszkoda translacyjna i zapobiegają nadekspresji. Zakładamy, że funkcją promotora umiejscowionego w eksonie 2 jest generowanie transkryptów nNOS za pomocą krótkich, wysoce translacyjnych 5 -UTR. Umożliwiłoby to komórce szybkie indukowanie ekspresji białka nNOS w odpowiedzi na bodźce. W związku z tym przetestowaliśmy wydajność translacyjną zróżnicowanych nukleotydów nNOS 5 w obu lizatach i komórkach transfekowanych. Konstruktory reporterowe lucyferazy zaprojektowano tak, aby odzwierciedlały natywny 5 -UTR pochodzący z opisanego tutaj promotora związanego z egzonem. Wydajność translacyjną tego gatunku RNA porównano z innymi sekwencjami IL-5 -UTR nNOS. Interesujące, wydajność translacyjna konstruktów reporterowych lucyferazy odzwierciedlających mNNA nNOS pochodzących z promotora eksonu 2 (Ex2-Short) była zwiększona o ponad 200% w komórkach i ponad 450% w lizatach w porównaniu z eksonem 2 nNOS o pełnej długości. (Ex2-Long) (rysunek 8, A i B). W porównaniu z transkryptem pochodzącym od powszechnego ludzkiego promotora nNOS 1c (Ex-1c) (29), wydajność translacyjna wzrosła ponad 24-krotnie. Ta dramatyczna zmiana w wydajności translacji była również obserwowana w przejściowo transfekowanych komórkach typu PC12 szczurzego PCLA i chomika CHO-K1 (dane nie przedstawione), co sugeruje, że ten efekt nie był ograniczony gatunkowo lub komórkowo. Następnie staraliśmy się ustalić, czy wydajność translacyjna mNNA nNOS uzyskanego z promotora eksonu 2 (Ex2-Short) była specyficznie zmieniona w warunkach beztlenowych, ponieważ mogłoby to wyjaśnić dramatyczną indukcję nNOS podczas niedotlenienia. Hodowane myocyty transfekowane konstruktem RNA Ex2-Short lucyferazy nie wykazywały żadnych zmian w aktywności lucyferazy Firefly, niezależnie od tego, czy komórki hodowano w warunkach normoksycznych, czy niedotlenionych (1% O2). Ex2-Short porównywano z mRNA Ex-1c i Ex2-Long i podobnie, nie obserwowano zmiany aktywności lucyferazy w warunkach beztlenowych (Figura 8C). Wyniki te wskazują, że powstające transkrypty mRNA Ex2-Short są nadal skutecznie przekształcane w niedotlenienie. Ryc. 8 Wpływ niedotlenienia na translację egzonów liderów nNOS. (A) Projektowanie monocystronowych konstruktów reporterowych lucyferazy. Zróżnicowane ludzkie sekwencje 5 -UTR nNOS umieszczono powyżej ORF lucyferazy. (B) Wpływ różnych sekwencji liderowych nNOS na wydajność translacyjną reporterowych RNA. Transkrypcyjnie, transkrypcyjnie, transkryptowane RNA nNOS 5 (3 -UTR / lucyferazy transformowano przejściowo w lizatach retikulocytów królika lub przejściowo transfekowano do hodowanych miocytów C2C12. Dane są wyrażone jako średnia. SEM z 3 niezależnych eksperymentów, każdy przeprowadzony w trzech powtórzeniach. * P <0,05 dla różnicy od wartości Ex2-Long (Ex2-L). Ex2-S, Ex2-Short; Vct, tylko wektor. (C) W badaniach oceniano wpływ normoksji (białe słupki) w porównaniu z niedotlenieniem (5 godzin, czarne słupki) na reporterową aktywność lucyferazy Firefly w hodowanych miocytach (komórki C2C12) przejściowo transfekowanych konstruktami RNA zawierającymi nNOS Ex-1c, Ex2-Short, oraz sekwencje liderów Ex2-Long. Pokazane jest średnie. SEM z 3 niezależnych eksperymentów, każdy przeprowadzony w trzech powtórzeniach [więcej w: twardzina układowa objawy, dieta przy dnie moczanowej tabela, szpital dziecięcy lublin chodźki ] [patrz też: koszulki ratownik medyczny, twardzina układowa objawy, vegantalgin ] [przypisy: koszulki ratownik medyczny, twardzina układowa objawy, vegantalgin ]