ROS generowane przez pyłek oksydazy NADPH dostarczają sygnału, który zwiększa indukowane antygenem alergiczne zapalenie dróg oddechowych ad 9

Błony inkubowano w buforze blokującym zawierającym 5% BSA w buforze TBST (20 mM Tris-zasada, 137 mM NaCl, pH 7,6 i 0,05% Tween 20) przez godzinę, a następnie inkubowano w pierwszorzędowym Ab (królicze poliklonalne przeciwciało ludzki p67phox, nr katalogowy SC-15342, Santa Cruz Biotechnology Inc.) przez godzinę. Alternatywnie, w przypadku analizy p38 MAPK, zastosowano oczyszczony przez powinowactwo królicze poliklonalne Ab wobec ufosforylowanego p38 MAPK (New England Biolabs). Po przemyciu 5 razy w buforze TBST, bloty inkubowano przez 30 minut ze sprzężonym z HRP drugorzędowym Ab (osiołowe przeciwciało przeciw-królicze skoniugowane z HRP, nr katalogowy NA 934, Amersham Biosciences). Bloty opracowano z użyciem ulepszonego substratu chemiluminescencji (ECL; Amersham Biosciences) zgodnie z protokołem producenta. Badania immunofluorescencji. Continue reading „ROS generowane przez pyłek oksydazy NADPH dostarczają sygnału, który zwiększa indukowane antygenem alergiczne zapalenie dróg oddechowych ad 9”

ROS generowane przez pyłek oksydazy NADPH dostarczają sygnału, który zwiększa indukowane antygenem alergiczne zapalenie dróg oddechowych ad 8

W tym modelu uszkodzone lub zestresowane tkanki generują czynniki, które aktywują komórki prezentujące antygen. Ostatnio zaproponowano, że wewnętrzne proteazy w HDM indukują sygnał niebezpieczeństwa. ułatwia uczulenie na antygeny roztoczy (71). Badanie, czy indukcja ROS przez pyłki oksydazy NADPH stanowi sygnał niebezpieczeństwa, jest potrzebne. W obecnym badaniu wykazaliśmy, że oksydaza pyłku NADPH może indukować specyficzną produkcję IgE. Continue reading „ROS generowane przez pyłek oksydazy NADPH dostarczają sygnału, który zwiększa indukowane antygenem alergiczne zapalenie dróg oddechowych ad 8”

ROS generowane przez pyłek oksydazy NADPH dostarczają sygnału, który zwiększa indukowane antygenem alergiczne zapalenie dróg oddechowych ad 7

W tym modelu, ROS generowane przez pyłki oksydazy NADPH indukują stres oksydacyjny (sygnał 1) niezależnie od adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Produkty wytwarzane przez stres oksydacyjny, taki jak GSSG i 4-HNE, ułatwiają alergiczne zapalenie dróg oddechowych indukowane przez antygen pyłkowy (sygnał 2). Wpływ sygnału obserwuje się po 24 godzinach po prowokacji, ponieważ rekrutacja neutrofili jest niezależna od odporności adaptacyjnej, ale jego działanie zanika po 72 godzinach po prowokacji, chyba że adaptacyjna odpowiedź immunologiczna ułatwi proces. Ten model wyjaśnia, dlaczego białka pyłkowe, które nie zawierają oksydaz NADPH iw konsekwencji nie mogą dostarczyć sygnału (Amb a 1, RWEH i pRWEOX.) Nie są w stanie wywołać silnego alergicznego zapalenia płuc. Nasze dane pokazują, że sygnał nie musi być specjalnie indukowany przez oksydazy NADPH, ponieważ można go zastąpić zastępczym systemem generowania ROS (tj. Continue reading „ROS generowane przez pyłek oksydazy NADPH dostarczają sygnału, który zwiększa indukowane antygenem alergiczne zapalenie dróg oddechowych ad 7”

ROS generowane przez pyłek oksydazy NADPH dostarczają sygnału, który zwiększa indukowane antygenem alergiczne zapalenie dróg oddechowych ad 6

Odkrycia te wskazują, że indukowany stresem oksydacyjnym sygnał rekrutuje neutrofile do płuc niezależne od adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Ponieważ główną cechą sygnału jest GSSG i tworzenie 4-HNE w płynie do wyłożenia dróg oddechowych (Figura 3, A i B), zbadaliśmy udział tych produktów stresu oksydacyjnego w indukcji rekrutacji neutrofili. Podejście myszy naiwnych do nietoksycznych stężeń GSSG i 4-HNE indukowało 3- do 4-krotną rekrutację neutrofili i całkowitych komórek zapalnych w porównaniu z prowokacją PBS (figura 7, B i C). Traktowanie hodowanych komórek A549 GSSG i 4-HNE szybko (w ciągu 5 minut) wywołało fosforylację tyrozyny p38 MAPK (Figura 7D) i późniejsze wytwarzanie IL-8 (Figura 7E). Przeprowadzono również test genu reporterowego IL-8 / lucyferazy w celu zbadania wpływu GSSG i 4-HNE na promotor IL-8 (59). Continue reading „ROS generowane przez pyłek oksydazy NADPH dostarczają sygnału, który zwiększa indukowane antygenem alergiczne zapalenie dróg oddechowych ad 6”

Peptydowy inhibitor peptydu ARF FoxM1 w leczeniu raka wątrobowokomórkowego myszy ad 5

Przeciwnie, immunobarwienie p27Kip1 było przeważnie cytoplazmatyczne w zmutowanym peptydzie ARF37a44. Badania te wskazują, że peptyd WT ARF26 . jest skuteczny w zmniejszaniu funkcji FoxM1 in vivo i że akumulacja jądra białka p27Kip1 była związana ze zmniejszoną proliferacją nowotworu wątroby. Figura 4 przedstawia terapię peptydem ARF26P44 powodującą akumulację jądrową białka p27Kip1 w mysich nowotworach HCC. (A (3F) Nuklearna akumulacja białka p27Kip1 w nowotworach HCC z myszy traktowanych peptydem WT ARF26a44a i dsRNA Mx-CreFoxm1a /. Continue reading „Peptydowy inhibitor peptydu ARF FoxM1 w leczeniu raka wątrobowokomórkowego myszy ad 5”

Peptydowy inhibitor peptydu ARF FoxM1 w leczeniu raka wątrobowokomórkowego myszy czesc 4

Znakowanie fluorescencyjne TMR ujawniło, że peptyd WT ARF26 . był zlokalizowany w cytoplazmie hepatocytów i jąderku (biała strzałka) oraz w wątrobowych komórkach mezenchymalnych (żółta strzałka). (H i I) Zarówno zmutowany peptyd ARF37a44 jak i peptyd WT ARF26P są skierowane do cytoplazmy hepatocytów i jąderka (białe strzałki), co określono za pomocą laserowej mikroskopii konfokalnej. Immunobarwne sekcje nowotworu z przeciwciałem swoistym dla białka NPM (czarne strzałki) (J) lub białka FoxM1 (K . M). Continue reading „Peptydowy inhibitor peptydu ARF FoxM1 w leczeniu raka wątrobowokomórkowego myszy czesc 4”

Peptydowy inhibitor peptydu ARF FoxM1 w leczeniu raka wątrobowokomórkowego myszy cd

W celu wytworzenia CML Foxm1 myszy wstrzyknięto syntetyczny dsRNA w celu indukcji ekspresji transgenu transfekowanej Mx-Cre (Mx-Cre), aby usunąć mysi allel skierowany przeciwko Foxm1fl / fl w 30 tygodniu po traktowaniu DEN / PB, a myszy następnie poddano 10 dodatkowych tygodniom promocji nowotworu PB i znakowano BrdU, jak opisano w Metodach. Kontrole obejmowały myszy Foxm1fl / fl traktowane dsRNA i myszy Mx-CreFoxm1fl / fl traktowane PBS. PN, po urodzeniu. (B. D) dsRNA CKO Mx-CreFoxm1. Continue reading „Peptydowy inhibitor peptydu ARF FoxM1 w leczeniu raka wątrobowokomórkowego myszy cd”

Peptydowy inhibitor peptydu ARF FoxM1 w leczeniu raka wątrobowokomórkowego myszy ad

Ekspresja FoxM1 (lub FoxM1b) jest wszechobecna we wszystkich proliferujących komórkach ssaczych, a jego ekspresja jest indukowana podczas fazy G1 cyklu komórkowego i trwa w fazie S i mitozy (19. 23). Aktywność transkrypcyjna FoxM1b wymaga aktywacji szlaku RAS / MAPK i wiązania aktywowanych kompleksów CDK-cyklina do domeny aktywacyjnej, która pośredniczy w zależnej od fosforylacji rekrutacji koaktywatora transkrypcyjnego wiążącego białko CREB (CBP) (24). Badania regeneracji wątroby, w których wykorzystano transgen genowy promotor / wzmacniacz alfa, cre-recombinaza (Alb-Cre) do pośredniczenia w delecji specyficznej wobec hepatocytów mysiego allelu ukierunkowanego na Foxm1 LoxP / LoxP (Foxm1fl / fl) wykazały, że Foxm1 jest wymagany do replikacji i mitozy DNA hepatocytów ( 25). Hepatocyty z niedoborem Foxm1 gromadzą poziomy jądrowe białek inhibitora CDK (CDKI) p21Cip1 i p27Kip1 (8, 25), ponieważ FoxM1 reguluje ekspresję białka 2 związanego z kinazą S (Skp2) i podjednostki CDK (26). Continue reading „Peptydowy inhibitor peptydu ARF FoxM1 w leczeniu raka wątrobowokomórkowego myszy ad”

Peptydowy inhibitor peptydu ARF FoxM1 w leczeniu raka wątrobowokomórkowego myszy

Czynnik transkrypcyjny m-widełki (Foxm1) jest niezbędny do zapoczątkowania indukowanych przez rak nowotworów wątroby; nie wiadomo jednak, czy FoxM1 stanowi cel terapeutyczny w leczeniu raka wątroby. W tym badaniu wykorzystano traktowanie dietylo-nitrozoaminą / fenobarbitalem w celu wywołania nowotworów wątrobowokomórkowych (HCC) u myszy WT lub myszy Arfc / A Rosa26-FoxM1b Tg, w których nadkłęboką skrzynkę widłową M1b (FoxM1b) nadekspresjonowano i blokowano alternatywną ramkę odczytu (ARF) aktywności transkrypcyjnej FoxM1 jest wyeliminowany. Aby farmakologicznie zmniejszyć aktywność FoxM1 w HCC, poddaliśmy te myszy z HCC codziennym iniekcjom hamującego peptyd inhibitora funkcji FoxF1 ARF26 .. Po 4 tygodniach tego leczenia, regiony HCC wykazywały zmniejszoną proliferację komórek nowotworowych i angiogenezę oraz znaczny wzrost apoptozy w regionie HCC, ale nie w sąsiadującej prawidłowej tkance wątrobowej. Terapia peptydem ARF indukuje również apoptozę kilku różnych ludzkich linii komórek wątrobiaka, które korelują ze zmniejszonymi poziomami białka mitotycznych genów regulatorowych kodujących polo-podobną kinazę 1, kinazę Aurora B i surwiwinę, z których wszystkie są celami transkrypcyjnymi FoxM1, które są wysoce wyrażane w komórkach rakowych i działają w celu zapobiegania apoptozie. Continue reading „Peptydowy inhibitor peptydu ARF FoxM1 w leczeniu raka wątrobowokomórkowego myszy”

Peptydowy inhibitor peptydu ARF FoxM1 w leczeniu raka wątrobowokomórkowego myszy ad 11

W oparciu o te badania, peptyd WT ARF26 będzie specyficznie zmniejszał funkcję Foxm1 in vivo w celu ograniczenia wzrostu HCC i indukowania apoptozy HCC bez zmniejszania funkcji innych znanych celów hamujących białka supresorowego guza ARF. Po wstrzyknięciu ip wchłonięty peptyd WT ARF26 . wchodzi do krążenia wrotnego, a następnie przepływa do wątrobowych kapilar sinusoidalnych, które są wyłożone fenestrowanymi komórkami śródbłonka, które umożliwiają wydajne dostarczanie peptydu ARF do leżących poniżej hepatocytów i komórek mezenchymalnych wątroby (68). . Jednakże traktowanie peptydem WT ARF26a 44 myszy nie powodowało efektów ubocznych, ponieważ nie mogło przejść przez barierę komórek śródbłonka naczyń krwionośnych do komórek nabłonka jelitowego, okrężniczego, płucnego, trzustkowego lub nerkowego (dane nie pokazane). Continue reading „Peptydowy inhibitor peptydu ARF FoxM1 w leczeniu raka wątrobowokomórkowego myszy ad 11”