Peptydowy inhibitor peptydu ARF FoxM1 w leczeniu raka wątrobowokomórkowego myszy cd

W celu wytworzenia CML Foxm1 myszy wstrzyknięto syntetyczny dsRNA w celu indukcji ekspresji transgenu transfekowanej Mx-Cre (Mx-Cre), aby usunąć mysi allel skierowany przeciwko Foxm1fl / fl w 30 tygodniu po traktowaniu DEN / PB, a myszy następnie poddano 10 dodatkowych tygodniom promocji nowotworu PB i znakowano BrdU, jak opisano w Metodach. Kontrole obejmowały myszy Foxm1fl / fl traktowane dsRNA i myszy Mx-CreFoxm1fl / fl traktowane PBS. PN, po urodzeniu. (B. D) dsRNA CKO Mx-CreFoxm1. /. guzy wątroby nie wykazują wykrywalnego barwienia jądrowego białka Foxm1, jak określono przez immunobarwienie z użyciem przeciwciała Foxm1. (E. G) Barwienie H & E wskazanych fragmentów wątroby HCC po 40 tygodniach ekspozycji DEN / PB (marginesy guza oznaczone strzałkami). (H. J) Inkorporację BrdU wykryto przez immunobarwienie sekcji nowotworu wątroby monoklonalnym przeciwciałem BrdU od wskazanych myszy po 40 tygodniach po ekspozycji na DEN / PB. Strzałki wskazują barwienie jądrowe dla białka Foxm1 lub BrdU. (K) Wykres średniej liczby komórek BrdU-dodatnich na milimetrowy guz wątroby (SD) na milimetr kwadratowy, jak opisano w Metodach. Gwiazdki wskazują statystycznie istotne zmiany: ** P. 0,01 i *** P. 0,001. Ad., Gruczolaki wątroby. Powiększenie: x 200 (B. G); × 400 (H = J). Zastosowaliśmy skrawki wątroby barwione H & E w celu określenia liczby guzów na centymetr kwadratowy tkanki wątroby (Figura 1, E. G). Aby obliczyć powierzchnię lub wielkość guzów wątroby, wykorzystano mikrofotografie przekrojów guzów wątroby wybarwionych H & E za pomocą mikroskopu Axioplan 2 (Zeiss) i programu AxioVision (wersja 4.3, Zeiss). Po 40 tygodniach ekspozycji na DEN / PB myszy kontrolne wykazywały gruczolaki i HCC wątroby większe niż 2 mm2 (Tabela 1). Delecja Foxm1 w istniejących guzach wątroby w dsRNA CKO Mx-Cre Foxm1. /. u myszy wystąpiło istotne zmniejszenie liczby guzów wątroby większych niż 2 mm2 w porównaniu z kontrolnymi guzami wątroby po 40 tygodniach ekspozycji DEN / PB (Tabela 1). Następnie zmierzono proliferację komórek nowotworowych, określając liczbę wątrobowych komórek nowotworowych, które wybarwiono immunologicznie dla inkorporacji BrdU (Figura 1, H. J). W porównaniu do kontroli, dsRNA CKO Mx-CreFoxm1. /. myszy wykazały 80-procentową redukcję liczby komórek nowotworowych wątroby, które wybarwiały się dodatnio na BrdU po 40 tygodniach leczenia DEN / PB (Figura 1K). Podsumowując, wyniki te wskazują, że delecja Foxm1 w istniejących wcześniej nowotworach wątroby znacznie zmniejszyła proliferację i wzrost komórek raka wątroby. Tabela Terapia peptydem WF ARF zmniejsza liczbę i wielkość gruczolaków wątrobowych i HCC na tkankę wątrobową centymetra kwadratowego. Peptyd WT ARF26a przenikliwy dla komórek celuje w endogenne mysie białko FoxM1 w jądro wątrobowych komórek nowotworowych. Wcześniej zsyntetyzowaliśmy penetrujący komórkę peptyd ARF26 . połączony z 9 N-końcowymi resztami D-Arg (32, 33), które skutecznie transdukowały do komórek U2OS osteosarcoma i hamowały aktywność transkrypcyjną FoxM1b (8). Traktowanie komórek U2OS 12. M (D-Arg) 9-ARF26P44 (WT ARF26P44) peptyd fluorescencyjnie znakowany docelową jądrową fluorescencją GFP-FoxM1b ukierunkowaną na tetrametylorododorze (TMR) kolokalizowaną czerwoną fluorescencją peptydu WT ARF26. jąderka (ryc. 2, C i D). Przeciwnie, białko GFP-FoxM1b pozostawało jądrowe w komórkach U2OS po traktowaniu zmutowanym TMR (D-Arg) 9-ARF37a 44 zmutowanym (zmutowanym ARF37a44) peptydem (D-Arg) (Figura 2E), w którym brakowało aminokwasów 26 <37 wymagane do interakcji z białkiem FoxM1b (8). Ponieważ sekwencje bogate w Arg są wystarczające do ukierunkowania nukleolarnego (38), zmutowana fluorescencja peptydu ARF37S44 również jest zlokalizowana w jąderku komórek U2OS (Figura 2F). Nie zaobserwowaliśmy żadnego sygnału w nieobecności peptydu ARF (dane nie pokazane). Figura 2 Peptyd WT ARF26 . skierowany jest na białko FoxM1 nowotworu wątroby do jąderka. (A) Eksperymentalny schemat projektu leczenia peptydem ARF myszy niosących nowotwór wątroby. Nowotwory wątroby indukowano u myszy z ekspozycją na DEN / PB, a następnie poddawano im codziennie wstrzyknięciom ip peptydu WF ARF26 . 44 lub zmutowanego peptydu ARF374 (peptyd MUT ARF37a44), jak opisano w Metodach. (B. F) Białko GFP-FoxM1b jest kierowane do jąderka przez peptyd WT ARF26 .. Komórki U2OS transfekowano wektorem ekspresyjnym GFP-FoxMlb i albo pozostawiono nietraktowane albo inkubowano przez 48 godzin z TMR znakowanym fluorescencyjnie peptydem WT ARF26 . (C i D) lub zmutowanym peptydem ARF374 (E i F), a następnie analizowano pod kątem GFP (zielona) lub fluorescencja peptydowa (czerwona) [przypisy: lek doreta, koszt ubezpieczenia zdrowotnego, rehabilitacja po zerwaniu ścięgna achillesa ] [podobne: lek doreta, dieta przy dnie moczanowej tabela, aspargin ulotka ] [hasła pokrewne: lek doreta, dieta przy dnie moczanowej tabela, aspargin ulotka ]