Podwyższone w okresie dojrzewania 1 (EAP1) jest nowym regulatorem transkrypcji żeńskiej neuroendokrynnej osi rozrodczej ad 10

Aby wytworzyć siRNA przeciwko szczurzemu mRNA EAP1, najpierw sklonowano mRNA EAP1 z komórek HiB5 szczura hipokampa i zsekwencjonowaliśmy cały region kodujący). Trzy wstępnie zaprojektowane siRNA ukierunkowane na nt 309. 1,327 (siRl), 1,471. 1,489 (siR2) i 1,618. 636 (siR3) mRNA EAP1 zostały przebadane pod względem aktywności, jak opisano w Suplemencie 5. 2 najsilniejsze siRNA (siR1 i siRNA). siR3) poddano analizie funkcjonalnej w celu zweryfikowania ich swoistości docelowej wykorzystującej mRNA EAP1 niosące mutacje punktowe regionu docelowego przez każdy siRNA (uwaga dodatkowa 6). Następnie zastosowano sekwencję siR1 do wytworzenia konstruktu shRNA EAP1. Przygotowanie shRNA EAP1 i wytwarzanie wirusów. 53-merowy oligodeoksynukleotyd zawierający nity antysensowne i siarkowe EAP1 o długości 19 nt i oddzielone pętlą 9-nt pokazaną na Figurze 4B sklonowano w miejscach Apa I-EcoR I miejsca wielokrotnego klonowania kasety (pochodzącej z wektor pSilencer 1.0-U6; Ambion), w którym transkrypcja siRNA jest kierowana przez promotor polimerazy RNA U6 (50). Ta kaseta, włożona do 3. LTR lentiwirusowego konstruktu (27) jest w stanie dostarczyć zakodowane siRNA do mózgu (51). W celu wytworzenia cząstek wirusa, wykorzystaliśmy metodę z fosforanem wapnia (52) do kotransfekcji komórek 293T za pomocą 4 plazmidów; wektor lentiwirusowy-siRNA, pLP1, pLP2 i pLPv (Invitrogen) (27, 53). Plazmid pLP1 wyraża gag i pol; pLP2 wyraża Rev; a pLPv wyraża białko otoczki VSVG. Stężenie wirusa zwiększono przez ultrawirowanie (54), a miano wirusa oznaczono przez zakażenie naiwnych komórek 293T. Po zakażeniu seryjnymi rozcieńczeniami wirusa, procent komórek dodatnich pod względem GFP (fluorescencyjnych) określono za pomocą cytometrii przepływowej w ośrodku Rdzenia w Instytucie Terapii Szczepów i Gier, ONPRC (Suplementowa Figura 2). Miano wyrażano jako jednostki transdukcyjne na mililitr (TU / ml). Aby przetestować skuteczność cząstek wirusowych niosących kasety kodujące SHRNA EAP1, użyliśmy komórek HiB5. Wysiano je na 6-studzienkowej płytce przy gęstości 400 000 komórek / studzienkę w pożywce DMEM bez antybiotyków. Następnego dnia zakażono je wirusami kontrolnymi (LV eGFP), EAP1 shl lub EAP sh3 (przy 0,6 x 109 do 3,5 x 109 TU / ml) w objętości ml zawierającej Polybrene (16 ug / ml). Całkowity RNA wyekstrahowano 72 godziny po zakażeniu, a zawartość mRNA EAP1 zmierzono za pomocą półilościowego PCR, jak opisano w Notatce dodatkowej 2. Hybrydyzacja in situ i immunohistochemia. Mózgi małp i szczurów poddano hybrydyzacji i / lub barwieniu immunologicznemu, jak opisano w Suplemental Note 3. Imaging. Po zakończeniu reakcji immunofluorescencyjnych (uwaga uzupełniająca 3), obrazy fluorescencyjne zebrano i analizowano jak opisano w Notatce dodatkowej 9. Statystyka. Różnice między 2 grupami zwierząt lub niezależnymi obserwacjami analizowano przy użyciu testu dwustronnego ucznia. Gdy porównano kilka grup, różnice analizowano za pomocą jednokierunkowej ANOVA, a następnie testu wielokrotnego porównania Studenta-Neumana-Keulsa dla nierównych powtórzeń. Materiały uzupełniające Zobacz Dodatkowe dane Podziękowania Dziękujemy firmie Anda Cornea (Rdzeń obrazowania i obrazowania ONPRC) za obrazowanie i analizę obrazu oraz W. Les Dees (Wydział Anatomii Weterynaryjnej i Zdrowia Publicznego, Texas A & M University, College Station, Texas, USA) za wykonanie LH i radioimmunologiczne oznaczenia FSH. Dziękujemy również Marii Costa, Leeli Goodspeed, Brigitte Andresen i Giseli Hohmann za fachową pomoc techniczną. Praca ta została wsparta dotacjami z NIH, Narodowego Instytutu Zdrowia Dziecka i Rozwoju Społecznego / NIH (do SR Ojeda), Europejskiego Towarzystwa Endokrynologii Pediatrycznej (do H. Junga), Niemieckiej Fundacji Badawczej (do S. Hegera) oraz Komisja Europejska (PIONEER do S. Hegera). Przypisy Niestandardowe skróty: ARC, łukowate jądro; AVPV, przednowotworowe jądro okołokomorowe; CTX, kora mózgowa; EAP1, wzmocniony w okresie dojrzewania 1; eGFP, ulepszone GFP; FSH, hormon folikulotropowy; GnRH, hormon uwalniający gonadotropiny; LH, hormon luteinizujący; MBH, przyśrodkowy podstawowy podwzgórze; POA, obszar preoptyczny; shRNA, krótkie RNA o strukturze spinki do włosów; TTF1, czynnik transkrypcji tarczycy 1; TU, jednostka (jednostki) przekazujące. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J. Clin. Invest.117: 2145. 2154 (2007). doi: 10.1172 / JCI31752 Obecny adres Sabine Heger to: Katedra Endokrynologii Dziecięcej, Szpital Dziecięcy auf der Bult, Hanower, Niemcy. Obecny adres Claudio Mastronardi to: Wydział Psychiatrii i Nauk Behawioralnych, University of Miami School of Medicine, Miami, Floryda, USA. Obecny adres Ricardo Cabrera to: Laboratorio de Investigaciones Neuroquimicas y Endocrinas, Universidad Nacional de Cuyo, Mendoza, Ar Obecny adres Rotha to: Department of Pediatrics, Seattle Children s Hospital Research Institute, Seattle, Washington, USA. Obecny adres Heike Junga to: Eli Lilly & Co., Bad Homburg, Niemcy. Sabine Heger i Claudio Mastronardi w równym stopniu przyczynili się do tej pracy.
[podobne: przygotowanie do rozmowy kwalifikacyjnej, twardzina układowa objawy, szpital dziecięcy lublin chodźki ]
[przypisy: przeziernosc karkowa, debutir ulotka, microgynon ulotka ]
[hasła pokrewne: przeziernosc karkowa, debutir ulotka, microgynon ulotka ]