Podwyższone w okresie dojrzewania 1 (EAP1) jest nowym regulatorem transkrypcji żeńskiej neuroendokrynnej osi rozrodczej ad 5

Produkty PCR frakcjonowane pod względem wielkości w 2% żelu agarozowym zabarwionym bromkiem etydyny. RT, bez produktu do odwrotnej transkrypcji. MM, markery molekularne. (E) Jako jednostkę normalizującą zastosowano analizę densytometryczną żelu pokazaną w D. mRNA cyklofili- ny (Cyclo), gen porządkowy. Odpowiednio, poziomy mRNA OAS1 są wyrażone jako średnie. SEM (AU) stosunku mRNA dla OAS1 / cyklofilina obliczono dla każdej grupy (n = 3). Po spełnieniu podwójnego kryterium siły i swoistości, określiliśmy wpływ specyficznego dla regionu spadku produkcji EAP1 na początek dojrzałości płciowej i dorosłej cykliczności reprodukcyjnej. Jeden mikroleter lentiwirusa wytwarzającego shlA EAP1 (3,6 x 106 jednostek transdukcji [TU] / AI) został poddany mikroiniekcji dwustronnie do POA młodocianych 23-dniowych samic szczurów (Uwaga dodatkowa 8). W przypadku tego gatunku, POA zawiera większość neuronów GnRH zaangażowanych w podwzgórzową kontrolę wydzielania gonadotropiny przysadkowej i jest niezbędna do nawracających skoków uwalniania gonadotropin podczas cyklu rujowego (29). Zwierzętom kontrolnym wstrzyknięto zwiększone wirusy wytwarzające GFP (wytwarzające eGF) niosące samą kasetę promotora U6 (LG eGFP). Identyfikacja komórek wykazujących ekspresję eGFP wykazała, że miejsce wstrzyknięcia było prawidłowo ukierunkowane na POA w kontrolach, którym wstrzyknięto eGFP 8 8 LV i 6 szczurom, którym wstrzyknięto SH1A EAP1. Dobrze rozmieszczone iniekcje infekują neurony zlokalizowane w przedsionkowo-rdzeniowym jądrze okołokomorowym (AVPV) i / lub bocznym aspekcie tego jądra (Figura 5, A i B). AVPV jest regionem POA wymaganym do przedowulacyjnego uwalniania gonadotropin (30). Figura 5A pokazuje komórki znakowane eGFP umieszczone wzdłuż bocznych granic AVPV; Figura 5B pokazuje komórki pozytywne dla eGFP w grzbietowej i środkowej części prawego AVPV; chociaż nie zaobserwowano żadnych komórek dodatnich w lewym AVPV, kolejne sekcje wykazały obecność zainfekowanych komórek w tym regionie (dane nie pokazane). Przykład niewłaściwie umieszczonych iniekcji (zbyt boczny i zbyt ogonowy do POA) pokazano na rysunku 5C. Widok o większym powiększeniu ujawnił, że większość zainfekowanych komórek stanowiły neurony (Figura 5D), w tym neurony GnRH (Figura 5E). Komórki traktowane E1i1 shl (zielone) miały zmniejszoną zawartość immunoreaktywnego materiału EAP1 w porównaniu z niezainfekowanymi komórkami (tylko czerwone) (Figura 5, FłH). Półilościowa analiza obrazu (Uwaga dodatkowa 9) wykazała, że spadek ten był znaczny (P <0,01) (rysunek 5I). Figura 5Lientivirus, w którym pośredniczy lentiwirus in vivo, dla ShAr EAP1 szczurzego POA obniża poziomy białka EAP1. Obrazy ilustrują wyniki uzyskane od 8 zwierząt kontrolnych, którym wstrzyknięto eGFP LV, u 6 zwierząt prawidłowo wstrzyknięto E1i1-sz1 i 2 zwierząt z niewłaściwie wprowadzonymi wstrzyknięciami EAP1-sz1. (A i B) Przykłady dobrze ulokowanych iniekcji niosących lentiwirusy koduj ące Shlq EAP1. Zakażone komórki są widoczne wzdłuż bocznej krawędzi (A) lub grzbietowo-środkowego aspektu (B) AVPV. (C) Przykład niewłaściwie zastrzyków (zbyt boczny i zbyt ogonowy). (D) Obraz o większym powiększeniu pokazujący, że większość zainfekowanych komórek ma morfologię neuronów. (E) Przykład zainfekowanego neuronu GnRH (żółty). (F. I) Zawartość białka EAP1 (czerwony) była zmniejszona w neuronach zakażonych E1.1 sh1 (zielony). (F) Droga wtrysku, bogata w neurony ekspresjonujące eGFP, wykazuje mniej komórek EAP1-dodatnich (czerwonych) niż sąsiednie obszary. (G) Obrazy o większym powiększeniu ilustrujące redukcję immunoreaktywnego materiału EAP1 (czerwonego) w jądrze komórek zakażonych shlA EAP1 (eGFP-dodatni, zielony) w porównaniu z komórkami niezakażonymi (tylko EGFP, czerwone). (H) To samo pole co w G, ale wykazujące tylko immunoreaktywność EAP1 (czerwony), aby zilustrować utratę białka EAP1 w komórkach zakażonych shlp EAP1. (I) Intensywności fluorescencji w jednostkach AU na podstawie pomiarów 36 zainfekowanych i 104 niezainfekowanych komórek. *** P <0,01 versus niezainfekowane komórki. Pręty skali: 20 m (D); 5 m (E); 50 m (F); 10 .m (G i H). Liczby w nawiasach reprezentują liczbę studzienek na grupę, a słupki błędu to SEM. Strzałki w punkcie A C wskazują miejsca wstrzyknięcia; strzałki w G i H wskazują na zakażone komórki (G) wykazujące spadek immunoreaktywności EAP1 (H). Ocena rozwoju płciowego i cykliczności reprodukcyjnej wykazała, że początek dojrzewania (określony jako czas pierwszej owulacji) był opóźniony u szczurów otrzymujących SH1 eAP1 w POA w porównaniu ze szczurami, którym wstrzyknięto eGFP LV (Figura 6A). [hasła pokrewne: emedlink, koszt ubezpieczenia zdrowotnego, vegantalgin ] [podobne: koszulki ratownik medyczny, twardzina układowa objawy, vegantalgin ] [więcej w: koszulki ratownik medyczny, twardzina układowa objawy, vegantalgin ]