Podwyższone w okresie dojrzewania 1 (EAP1) jest nowym regulatorem transkrypcji żeńskiej neuroendokrynnej osi rozrodczej ad 9

Starsze szczury wykazujące zamkniętą pochwę, nagromadzenie płynu wewnątrzmacicznego i masę macicy poniżej 180 mg uważa się za znajdujące się we wczesnym okresie dojrzewania (wczesna faza zdrowienia). W końcu, szczury wciąż wykazują zamkniętą pochwę, ale pokazując macicę napełnioną płynem i ciężar macicy co najmniej 200 mg uważa się za w okresie dojrzewania (późna fazę dojrzewania płciowego), tj. Gdy pierwszy przedowulacyjny wzrost GnRH i gonadotropiny mają miejsce. Pierwsza owulacja występuje następnego dnia. Wszystkie zwierzęta uśmiercono między 16:00 a 17:00. Myszy z mutacją ob / ob (Lepob / Lepob) i kontrole C57BL / 6J typu dzikiego stosowane do oceny wpływu leptyny na podwzgórzową zawartość mRNA EAP1 zakupiono w The Jackson Laboratory. Regiony mózgu zebrane od małp, szczurów i myszy stanowiły MBH i próbki z CTX. MBH wycięto przez rostralne cięcie wzdłuż tylnej granicy chi- rurgii wzrokowej, ogonowe cięcie tuż przed ciałami sutkowymi i 2 boczne nacięcia wzdłuż podwzgórza podwzgórza. Grubość fragmentu tkanki wynosiła około 4 mm (małpy) i 2 mm (szczury i myszy). Po rozcięciu tkanki natychmiast zamrożono na suchym lodzie i przechowywano w ~ 85 ° C do ekstrakcji RNA. Aby ocenić wpływ wstrzyknięć dożylnych lentiwirusów kodujących shRNA EAP1 na rozwój rozrodczy kobiet i dojrzałą funkcję rozrodczą, szczury wstrzyknięto (uwaga dodatkowa 8) w pierwszej połowie okresu młodzieńczego (P23), a następnie zbadano pod kątem otwarcia pochwy, najpierw owulacji i cykliczności rui przy użyciu ustalonych kryteriów (2), jak opisano poniżej. Wykorzystanie naczelnych innych niż człowiek, szczurów i myszy zostało zatwierdzone przez Komitet ONPRC ds. Opieki nad Zwierzętami zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi wykorzystywania zwierząt w badaniach. Ocena dojrzewania płciowego i funkcji rozrodczych dorosłych. Zwierzęta badano każdego popołudnia w celu otwarcia pochwy, rozpoczynając 7 dni po wstrzyknięciu. Po wystąpieniu otworu pochwy wykonano płukanie pochwy codziennie, aby określić występowanie pierwszej rui, która u gryzoni objawia się przewagą komórek zrogowaciałych (2). Chociaż owulacja zwykle występuje w dniu rui (2), wykrycie zrogowaciałych komórek nie wskazuje, że doszło do owulacji, chyba że rogowacenie pochwy jest poprzedzone pojawieniem się dominacji leukocytów (45). Obecność tych komórek określa fazę przełyku cyklu rujowego i wskazuje, że po owulacji powstał funkcjonalny ciałko żółte. Z tych powodów wiek pierwszej owulacji uważano za osiągnięty tylko wtedy, gdy po zrogowaciałych komórkach następowało co najmniej 2 dni płukania zawierającego głównie leukocyty (46). Czterdzieści do czterdziestu czterech dni po iniekcji wewnątrz podwzgórza zwierzęta znieczulono tribromoetanolem (2,5 mg / 100 g masy ciała), pobrano krew przez nakłucie serca w celu oceny hormonalnej, a mózgi unieruchomiono w celu perfuzji immunohistochemicznej w miejscu wstrzyknięcia. Krążące poziomy LH i FSH oraz poziomy stężeń jajników w surowicy mierzono za pomocą RIA, jak opisano wcześniej (47). Jajniki szczurów, które wstrzyknięto w POA cząstkami wirusa kontrolnego eEGF E1, lub LV eGFP zostały usunięte, utrwalone w utrwalaczu Kahle, osadzone w parafinie, podzielone seryjnie na 6 .m, wybarwione hematoksyliną żelaza Weigert i zabarwione kontrastowo kwasem pikrynowym Błękit metylowy, jak podano wcześniej (48). Co dziesiąty odcinek został zobrazowany na Zeiss Axioplan za pomocą kamery CoolSNAP (Roper Scientific). Czułki zostały policzone przy użyciu funkcji ręcznego liczenia MetaMorph (Universal Imaging Co.). Uwzględniono tylko pęcherzyki, w których jądro komórki jajowej było widoczne, a całkowitą liczbę pęcherzyków na jajnik określono, jak podano wcześniej (48). Wszystkie pomiary przeprowadzono bez wcześniejszej znajomości leczenia zwierzęcia. Mikromacierze DNA, PCR w czasie rzeczywistym i testy promotora. Zmiany w ekspresji genów zachodzące w okresie dojrzewania w podwzgórzu małpki oceniano za pomocą ludzkich mikromacierzy cDNA (Supplemental Note 1), a wyniki sprawdzono za pomocą wcześniej opisanego protokołu PCR w czasie rzeczywistym (49) (Supplemental Note 2) . Ocenę aktywności trans regulacyjnej EAP1 (uwaga uzupełniająca 4) przeprowadzono w sposób opisany wcześniej (39). Klonowanie szczura, małpy i człowieka EAP1. Częściowe cDNA EAP1 lub cDNA zawierające cały region kodujący EAP1 z każdego z tych 3 gatunków klonowano do wektorów plazmidowych po amplifikacji PCR odwrotnego transkrybowania mRNA (Notatki Uzupełniające 2 i 4). Projektowanie i budowa siRNA
[przypisy: jaskółcze ziele zastosowanie, produkty o niskim indeksie glikemicznym wykaz, różyczka objawy u dorosłych ]
[więcej w: koszulka ratownictwo medyczne, jaskółcze ziele zastosowanie, aulin ulotka ]
[przypisy: koszulka ratownictwo medyczne, jaskółcze ziele zastosowanie, aulin ulotka ]