Podwyższone w okresie dojrzewania 1 (EAP1) jest nowym regulatorem transkrypcji żeńskiej neuroendokrynnej osi rozrodczej cd

W oparciu o wyżej opisane odkrycia zmieniliśmy nazwę genu wzmocnionego w okresie dojrzewania (EAP1). W podwzgórzu naczelnych mRNA EAP1 wykryty przez hybrydyzację in situ (uwaga dodatkowa 3) był obfity w komórkach podwzgórzowych jąder zaangażowanych w kontrolę wydzielania GnRH, takich jak jądro łukowate (ARC) (Figura 2, A i C). Zgodnie z obecnością sygnału lokalizacji jądrowej w sekwencji EAP1 (16), białko EAP1 wykryte za pomocą immunohistochemii przy użyciu przeciwciał poliklonalnych (Uwaga dodatkowa 3) było zlokalizowane w jądrach komórkowych (Figura 2, B i D). Stosując te same przeciwciała, stwierdziliśmy, że białko EAP1 jest również eksprymowane w regionach podwzgórza żeńskiego szczura uczestniczących w kontroli rozrodczej, takich jak przyśrodkowy obszar przedwzrokowy (POA), ARC i jądro ventromedial (VMH). Odkrycia te są zilustrowane na Figurze 2E, która pokazuje przy małym powiększeniu obecność immunoreaktywnego EAP1 w jądrach komórkowych ARC i VMH 28-dniowego nieletniego samica szczura. Wstępna adsorpcja przeciwciał z peptydem antygenowym całkowicie wyeliminowała barwienie (Figura 2F). Widoki wyższego powiększenia obu stanów pokazano odpowiednio na rysunku 2, G i H. Figura 2 Gen EAP1 jest wyrażany w podregionach naczelnych innych niż człowiek i podwzgórze szczura uczestniczących w kontroli rozrodczej. (A) Obraz o małym powiększeniu pokazujący, że ekspresja mRNA EAP1 jest widoczna w komórkach ARC podwzgórza naczelnych, ocenianej przez hybrydyzację in situ z użyciem specyficznej dla małpy sondy cAPA EAP1 znakowanego UTP [35S] UTP. Pokazana sekcja pochodzi od 8-letniej dorosłej samicy małpy. ME, mediana wzniosu podwzgórza; OC, chiazm wzrokowy; V, trzecia komora. Pasek skali: 300 .m. (B) Obraz montażowy podwzgórza małpiego (dorosła, 8-letnia samica małpy) pokazujący, że immunoreaktywne białko EAP1 jest preferencyjnie zlokalizowane w komórkach ARC. Linia przerywana przedstawia środkowe i boczne ARC. Pasek skali: 200 .m. (C) Widok A w dużym powiększeniu pokazujący, że mRNA EAP1 jest zlokalizowany w jądrach komórkowych, które wydają się być neuronowe, ponieważ są lekko zabarwione tioniną (przykłady oznaczone strzałkami). Pasek skali: 20 m. (D) Widok ARC o dużym powiększeniu pokazujący immunoreaktywny EAP1 w jądrach neuronalnych. Pasek skali: 20 m. (E) Widok MBH od niskiego powiększenia od 28-dniowego przedubojowego samic szczura wykazującego barwienie EAP1 w jądrach komórkowych jąder ARC i ventromedial (VMH) (zaznaczonych liniami przerywanymi). Reakcja immunohistochemiczna została rozwinięta na brązowy kolor z chlorowodorkiem diaminobenzydyny (uwaga dodatkowa 3), a jądra komórkowe wybarwiono kontrastowo 0,1% zieleni metylowej. (F) Brak barwienia EAP1 w sąsiedniej części inkubowanej z przeciwciałami EAP1 wstępnie adsorbowanymi peptydem antygenowym stosowanym do przygotowania przeciwciał (10 .g peptydu / ml antyserum, przez noc w 4 ° C). (G) Widok ARC o większym powiększeniu pokazujący barwienie EAP1 (brązowy) w jądrach komórkowych. Niektóre komórki nie zawierały EAP1, więc ich jądra mają tylko zielony kolor. (H) Sąsiednia sekcja barwiona przeciwciałami EAP1 wstępnie adsorbowanymi peptydem. Paski skali: 100 .m (w E i F); 20 m (G i H). Na skrawkach mózgu 28-dniowych młodych samic szczura wykryto białko EAP1 w jądrach neuronów zaangażowanych zarówno w ułatwienie jak i hamowanie wydzielania GnRH. Przykładowo, EAP1 był obecny w neuronach GnRH, które są wymagane do rozpoczęcia dojrzewania i funkcji rozrodczej dorosłych (Figura 3, A i B) i neuronów preproenkefalinergicznych (Figura 3, D. F), które biorą udział w kontroli hamowania wydzielania GnRH (19, 20). Stosując mikroskopię konfokalną, a następnie ograniczoną iteracyjną dekonwolucję i rekonstrukcję 3D, zaobserwowaliśmy (Figura 3C), że EAP1 (czerwony) był obecny w regionach jądrowych pozbawionych skondensowanej chromatyny (niebieski). Ponieważ uważa się, że te regiony są aktywne transkrypcyjnie (21), taka lokalizacja sugeruje, że EAP1 może być zaangażowany w regulację genów. EAP1 zawiera również domenę zwojową (16), co wskazuje na udział w oddziaływaniu białko-białko (22) i sekwencję domeny palcowej C3HC4 RING (23), co implikuje EAP1 w ubikwitynacji (24). Ze względu na ich przeciwne role w kontroli funkcji rozrodczych, wybraliśmy GnRH i geny Preroenkefaliny do eksperymentalnego testowania zdolności EAP1 do regulacji transkrypcji genu. Używając funkcjonalnych testów promotora (Uwaga dodatkowa 4), ustaliliśmy, że EAP1 transaktywuje promotor GnRH (Figura 3G), ale tłumi promotor przedrakowa krowianki (Fig. 3, H i I). Ten ostatni efekt zaobserwowano zarówno w komórkach GT1-7 wytwarzających GnRH (Figura 3H), jak i neuronowych komórkach hipokampa HiB5 (Figura 3I), co wskazuje, że podwójna transkrypcyjna aktywność EAP1 jest specyficzna dla promotora.
[więcej w: malowanie włosów w ciąży, jaskółcze ziele zastosowanie, twardzina układowa objawy ]
[przypisy: debutir ulotka, microgynon ulotka, dicortineff ulotka ]
[przypisy: debutir ulotka, microgynon ulotka, dicortineff ulotka ]