Podwyższone w okresie dojrzewania 1 (EAP1) jest nowym regulatorem transkrypcji żeńskiej neuroendokrynnej osi rozrodczej czesc 4

Wymaga również nienaruszonej domeny palca RING; delecja tej domeny lub pojedyncza substytucja aminokwasu (pierwsza cysteina do alaniny) uprzednio wykazana w celu zniesienia aktywności biologicznej domeny palca RING (25), zniszczyła zarówno działanie represyjne (preproenkefalina), jak i transaktywujące (GnRH) EAP1 (Figura 3, G. I). Chociaż podstawowa aktywność promotora GnRH była zauważalna niższa niż promotora preproenkefaliny, jest mało prawdopodobne, że ta zmniejszona aktywność mogła wpływać na odpowiedź promotora GnRH na EAP1. Obserwowaliśmy stymulujący wpływ EAP1 na ten promotor w kilku testach, niezależnie od podstawowego poziomu aktywności. Na przykład w teście, w którym podstawowa aktywność promotora GnRH była wysoka (1 279%. 61% w porównaniu z poziomami kontroli pGL3, n = 6), EAP1 w tej samej dawce pokazanej na Figurze 3G zwiększyło te wartości do 3 647%. 220% (n = 6). Figura 3EAP1 jest białkiem jądrowym o podwójnej aktywności transkrypcyjnej wyrażanym w neuronach podwzgórzowych, które ułatwiają lub hamują inicjację kobiecego dojrzewania płciowego. (A) Obraz konfokalny subregionu szczurzego POA 28-dniowej samicy szczura wykazujący, że EAP1 ma dominującą lokalizację jądrową (zielona). Zauważ, że nie wszystkie neurony zawierają EAP1, o czym świadczy brak zielonego zabarwienia w jądrach komórkowych zidentyfikowanych przez zabarwienie Hoechst (niebieskie). Długie strzałki wskazują komórki EAP1-pozytywne; krótkie strzałki wskazują komórki pozbawione EAP1. (B) Wykrywanie EAP1 (zielone) w jądrze neuronów GnRH (czerwone, strzałki). (C) Obraz szerokiego pola neuronu wyznakowanego dla EAP1 i Hoechst po ograniczonej iteracyjnej dekonwolucji i rekonstrukcji 3D pokazującej, że EAP1 (czerwony) nie jest związany ze skondensowaną chromatyną (niebieski). Skalowane pręty: 40 m (A); 20 m (B); 5 m (C). (D. F) Połączona immunohistochemia. Hybrydyzacja in situ skrawków mózgu od 28 do 30-dniowych samic szczurów wykazujących, że białko EAP1 jest obfite (D) w komórkach części brzuszno-brzusznej jądra brzuszno-przyśrodkowego (LVMH) podwzgórze, zidentyfikowane jako enkefalinergiczne pod względem zawartości mRNA preproenkefaliny (preproEnk) (E i F). Obraz o większym powiększeniu w F pokazuje, że wszystkie neurony zawierające mRNA z preproenkefaliną (białe ziarna) mają pozytywny EAP1 (brązowe zabarwienie, przykłady oznaczone strzałkami). 3 V, trzecia komora. (G. I) EAP1 ma podwójną transkrypcyjną aktywność regulacyjną, która wymaga nienaruszonej domeny palca RING. (G) W komórkach wytwarzających GnRH GT1-7, EAP1 transaktywuje promotor GnRH. (H) W tych samych komórkach tłumi promotor preproenkefaliny. (I) Ta represyjna aktywność jest również obserwowana w komórkach HiB5 neokolagatorów hipokampa. Zarówno aktywności transaktywujące jak i represyjne EAP1 są znoszone albo przez podstawienie pojedynczego aminokwasu (C = A) w domenie palca RING EAP1, albo przez delecję tej domeny (AR). Liczby powyżej słupków reprezentują liczbę studzienek / grupę, a słupki błędu to SEM. Aby określić znaczenie funkcjonalne EAP1 w kontroli in vivo funkcji reprodukcyjnej żeńskiej, zastosowaliśmy podejście polegające na utracie funkcji. Najpierw zsyntetyzowaliśmy siRNA (Supplemental Note 5) i odkryliśmy, że 2 z nich (siR1 i siR3) obniżały poziomy mRNA EAP1 o więcej niż 80% w liniach komórkowych (Suplementowa Figura 1A). Aby udowodnić swoistość celu, wygenerowaliśmy ciche mutacje w regionie mRNA EAP1, do którego skierowane jest siR1 lub siR3 (26) (Uwaga dodatkowa 6). Mutacje te uratowały mRNA EAP1 przed hamującym działaniem siRNA EAP1 (dodatkowa figura 1B). Następnie użyliśmy sekwencji siR1 lub siR3 do wygenerowania krótkich RNA o strukturze spinki do włosów (shRNA) w kontekście lentiwirusowym (Figura 4, A i B), jak opisano wcześniej (27). Używając tych cząstek wirusa (patrz Metody i Dodatkowa Figura 2), zainfekowaliśmy neuronowe komórki HiB5 w celu oceny siły wyciszania shRNA. Najbardziej skutecznym shRNA był SH1 e1, który zmniejszał ekspresję mRNA EAP1 o około 90% (Figura 4C). Ten efekt nie był związany z aktywacją szlaku interferonu (26, 28), co oceniono na podstawie braku zmian w 2., 5. mRNA syntetazy oligoadenylowej a 1, główny cel dla interferonu (26) (fig. 4, D i E, uwaga dodatkowa 7). Fig. 4 Za pośrednictwem mediatorowego dostarczania siRNA EAP1 zmniejsza się ekspresja mRNA EAP1 zarówno in vitro, jak i in vivo. (A) Zastosowano schemat użytego konstruktu lentiwirusa (27), pokazujący miejsce wstawienia kasety ekspresjonującej shRNA z promotorem U6. (B) Wytwarzanie SH1 EAP1 z kasety transkrypcyjnej skierowanej promotora U6. (C) Hamowanie ekspresji genu EAP1 w hiperampalnych neuronalnych komórkach progenitorowych HiB5 za pomocą Sh1 i -3 EAP1, zmierzonych 48 godzin po zakażeniu. Zawartość mRNA EAP1 wykryto metodą półilościowego PCR
[przypisy: koszt ubezpieczenia zdrowotnego, malowanie włosów w ciąży, zdrowa żywność zdrowy styl życia ]
[przypisy: ibum forte ulotka, szpital dziecięcy lublin chodźki, emedlink ]
[podobne: ibum forte ulotka, szpital dziecięcy lublin chodźki, emedlink ]