Proteolityczne przetwarzanie dynaminy przez cytoplazmatyczną katepsynę L jest mechanizmem białkowo-nerkowej choroby nerek ad 5

(B) W stanie podstawowym dynamin jest homotetramerem. Samoorganizacja w struktury wyższego rzędu, takie jak pierścienie lub spirale, może być promowana przez GTP . S i aktywuje hydrolizę GTP za pośrednictwem złożenia, która z kolei napędza demontaż. Średnia domena Dynamina znajduje się wewnątrz spirali. (C) Rekombinowany dyn1 (20 pmol) (CON) zmieszano z CatL (1 pmol) (górny panel), CatB (środkowy panel) lub Furin (dolny panel). Reakcje przeprowadzono przy pH 7,0 w warunkach niezmontowania (200 mM NaCl). Gdzie wskazano, obecne było 200. M GTP lub mM GTPyS. Produkty proteolityczne wykryto monoklonalnym przeciwciałem anty-dynaminowym przeciwko domenie GTPazy. (D) Barwienie srebrem rekombinowanego dynl inkubowanego z CatL przy różnych wartościach pH w obecności lub nieobecności GTPyS. (E) Analiza Western blot z użyciem przeciwciała GTPazy z ekstraktów z podocytów zakażonych różnymi mutantami dynamin przed lub po dodaniu 100 .g / ml LPS przez 20 godzin. Zwróć uwagę na pojawienie się fragmentu o wartości 40 kDa (strzałka). Gdy wskazano, podocyty traktowano .M selektywnego inhibitora CatL Z-FF-FMK przez czas trwania leczenia LPS. (F) Analiza Western błot frakcjonowania podkomórkowego podocytów eksprymujących dynWT przez 24 godziny po traktowaniu LPS. Ekstrakty były blotowane przy użyciu przeciwciał przeciwko domenie GTP-azy (N-koniec), domeny GAP (C-koniec), LAMP-2 i tubuliny. W celu dalszego zbadania cięcia dynaminami za pośrednictwem CatL, zakażono hodowane podocyty adenowirusami kodującymi różne mutanty dynaminowe (Figura 4A), a następnie traktowano je LPS. Zgodnie z oczekiwaniem, dodanie LPS do komórek eksprymujących dynWT spowodowało wytworzenie p40 (Figura 4E, ścieżka 6), które zostało zahamowane przez dodanie inhibitora CatL Z-FF-FMK (Figura 4E, ścieżka 5). Co ważne, leczenie LPS podocytów eksprymujących dynK44A (mutant, który nie może wiązać GTP) nie powodowało wykrywalnych poziomów p40 (Figura 4E, ścieżka 7), zgodnie z naszymi danymi, że rozszczepianie in vitro dynaminy przez CatL w neutralnym pH jest zależne od GTP . Aby potwierdzić tożsamość miejsca cięcia, stworzyliśmy dynL356Q, w którym sekwencja ELSGGA została zmutowana do EQSVGA. Dodanie LPS do hodowanych podocytów wykazujących nadekspresję dynL356Q nie dawało p40 (Figura 4E, ścieżka 9). Na koniec zbadano mutację dynaminową z uszkodzoną GTPazą, niosącą mutację w jego domenie GAP (dynR725A). Ta zmutowana dynamin oligomeryzuje, ale jest upośledzona w hydrolizie GTP stymulowanej przez zestaw (Figura 4B, odnośnik 19). Przewiduje się, że dynR725A będzie żył dłużej w stanie złożonym. Zgodnie z naszym modelem, traktowanie LPS komórkami eksprymującymi dynR725A nie generowało p40 (Figura 4E, ścieżka 8). Aby wykazać, że rozszczepienie dynamin przez CatL nastąpiło w cytoplazmie, przeprowadziliśmy eksperymenty frakcjonowania subkomórkowego. Tak więc N-końcowe p40 wykryto tylko w frakcji supernatantu (figura 4F, lewa ścieżka, GTPaza), podczas gdy C-końcowa część dynaminy została zdegradowana we frakcji peletek (figura 4F, prawy pas, GAP). Wszystkie te dane razem wspierają model, w którym CatL celuje w specyficzną dla GTP postać dynaminy w cytoplazmie, rozpoznając zachowany ewolucyjnie motyw ELSGGA, a samokompozycja dynamin w struktury wyższego rzędu, takie jak pierścienie lub spirale, zapobiega rozszczepianiu CatL. Aby wykazać, że dynamin jest cięty przez cytoplazmatyczną CatL podczas białkowej choroby nerek, szukaliśmy p40 w ekstraktach z nerki myszy po leczeniu LPS. Ponieważ przeciwciało GTPazy, które rozpoznaje p40, nie było wystarczająco czułe, aby wykryć endogenne fragmenty cięcia dynaminowego (dane nie pokazane), użyliśmy protokołu dostarczania genu do ekspresji dynaminy w nerkach myszy (15, 16). Dostarczono dyn1, ponieważ nadekspresja dyn2 czasami indukuje apoptozę (21). rt-PCR pokazał, że podocyty normalnie eksprymują dyn2 (postać wszechobecna) i pewną dyn3 (wyrażoną głównie w jądrach), ale nie dyn1 (izoformę neuronów; suplementowa figura 3A). Dyn1 wyrażano z promotora CMV (CMV-dyn) lub z podocytowego promotora podocin (POD-dyn, odnośnik 22). Dostarczony gen dyn1 został odróżniony od endogennego dyn2 za pomocą monoklonalnego przeciwciała dynaminowego MAB-5402, które w przeważającej mierze rozpoznaje dyn1 (Suplementowa Figura 3B). Zgodnie z oczekiwaniami, MAB-5402 słabo wybarwiał kontrolne kłębuszki (Figura 5A), podczas gdy silnie zabarwiał kłębuszki w 14 godzin po dostarczeniu CMV-dyn1 (Figura 5B) lub POD-dyn1 (Figura 5C). Ekspresję dynl skierowaną w promotor CMV w wątrobie i nerkach (Figura 5B, Western blot) i dyn1 wykryto w praktycznie wszystkich rezydentnych typach komórek kłębuszków nerkowych, w tym podocytach, jak widać po kolokalizacji z synaptopodyną (Figura 5B, Merge)
[przypisy: badanie psychotechniczne, twardzina układowa objawy, różyczka objawy u dorosłych ]
[więcej w: aulin ulotka, przeziernosc karkowa, debutir ulotka ]
[hasła pokrewne: aulin ulotka, przeziernosc karkowa, debutir ulotka ]