Proteolityczne przetwarzanie dynaminy przez cytoplazmatyczną katepsynę L jest mechanizmem białkowo-nerkowej choroby nerek ad 6

W przeciwieństwie do tego, promotor podocyny kierował ekspresję wyłącznie w nerkach i dyn1 zlokalizowane głównie w podocytacH. Obecność dyn1 w FP podocytów wykazano za pomocą EM (Supplemental Figure 3C). Co ważne, leczenie LPS doprowadziło do zmiany barwienia dostarczanego przez gen dyn1WT w kłębuszkach, podczas gdy barwienie dynL356Q i dynR725A pozostało niezmienione (figura 5D). Ponadto traktowanie LPS prowadziło do wytworzenia p40, ale tylko u myszy eksprymujących dynWT (Figura 5E, ścieżka 2), a nie u myszy eksprymujących dynL356Q i dynR725A (Figura 5E, ścieżki 4 i 6). Generacja p40 wymagała obecności CatL, ponieważ nie została wykryta w CatL. /. myszy, którym wstrzyknięto LPS (dodatkowa postać 3D). Western blot wykrył również fragment dynaminy o w przybliżeniu 55 kDa. Podobnie jak w hodowanych podocytach, obecność tego fragmentu była niezależna od LPS i CatL (Figura 5E, ścieżki 3 i 5 oraz Suplementowa Figura 3D), co potwierdza pogląd, że jest on wytwarzany przez inne proteazy podczas przygotowywania ekstraktu. Eksperymenty te rozszerzają nasze obserwacje na hodowanych podocytach i wskazują, że LPS indukuje rozszczepienie zależne od CatL u żywych myszy. Figura 5 Indukowane cięcie dynaminowe w nerkach myszy. (A (C) Podwójna immunofluorescencja dyn1 (przeciwciało MAB-5402, czerwone) i synaptopodin markera podocytów (zielony). Myszom wstrzyknięto wektor ekspresyjny kierowany przez podocynę pozbawiony genu dynaminy (A), wektora ekspresyjnego CMV-dyn1 (B) i wektora ekspresyjnego POD-dyn1 (C). Analiza Western błot całkowitej ekstraktów nerek i wątroby wyizolowanych ze zwierząt, którym wstrzyknięto różne cDNA, jak wskazano na figurze. (D) Immunocytochemia kłębuszków od myszy, którym wstrzyknięto LPS. Dwadzieścia cztery godziny po zastrzykach LPS zwierzęta otrzymywały cDNA eksprymujące dynWT, dynL356Q i dynR725A i zostały uśmiercone 14 godzin później. Glomeruli barwiono stosując monoklonalne przeciwciało anty-dynamina hudy 1. Oryginalne powiększenie × 400 (A. D). (E) Analiza Western blot wyciągów z nerek po dostarczeniu genów różnych cDNA dyn1 przy użyciu przeciwciała GTPase i CatL przed i po dodaniu LPS. Dynamina jest wymagana do normalnej czynności kłębkowej. Hipoteza mówiąca, że rozszczepienie dynaminy przez CatL prowadzi do białkomoczu implikuje, że dynamin jest niezbędny dla morfologii podocytów w zdrowych nerkach. Na poparcie tego poglądu ekspresja dominującego negatywnego dynK44A w mysich podocytach spowodowała znaczne białkomocz (figura 6A i tabela uzupełniająca 1) oraz zmniejszenie wymiaru FP (dodatkowa figura 4B, 14 godzin). Usuwanie białkomoczu i FP trwało maksymalnie 14 godzin po dostarczeniu genu i powróciło do wartości wyjściowych po utracie ekspresji dynK44A (dodatkowa postać 4, A i B, i danych nie przedstawiono). Ekspresja dynWT nie spowodowała zmian w architekturze FP (dane nie pokazane) ani znaczącego białkomoczu (Figura 6A i Tabela Uzupełniająca 1), wykazując specyficzność fenotypu dynK44A. Co ważne, ekspresja p40 również powodowała białkomocz (Figura 6A i Tabela Uzupełniająca 1), co pokazuje, że ten fragment dynaminowy ma dominujące negatywne właściwości w odniesieniu do funkcji podocytów. Ryc. 6 Wpływ mutantów dynamin na morfologię białkomoczu i podocytów. (A) Poziom białka w moczu określono przy użyciu standardowego testu Bradforda. Mocz pobrano bezpośrednio przed (0 godz.) I 14 i 24 godz. Po wstrzyknięciu podjednostkowych wektorów ekspresyjnych zawierających różne konstrukty dynaminy, jak wskazano na figurze. Każdy pasek reprezentuje co najmniej 10 zwierząt. (B) Hodowane podocyty zakażono adenowirusami eksprymującymi wskazane konstrukty dynamin. Osiemnaście godzin po zakażeniu komórki barwiono hudy (zielone), aby uwidocznić dynaminę i rodaminę falloidynę (czerwień), aby wizualizować F-aktynę. (C) Poziom białka w moczu określono przy użyciu standardowego testu Bradforda. Myszom wstrzyknięto 0 i 24 godziny LPS, aby wywołać białkomocz. Po 48 godzinach (szczytowa proteinuria) myszy otrzymały pusty wektor, CMV-dynWT, CMV-dynL356Q lub CMV-dynR725A. Stężenie białka w moczu określono po 12 godzinach od wstrzyknięcia. Każdy punkt danych reprezentuje co najmniej 10 zwierząt. (D) Poziom białka w moczu określono przy użyciu standardowego testu Bradforda. Myszom wstrzyknięto 0 i 24 godziny LPS, aby wywołać białkomocz. Po 48 godzinach (szczytowa proteinuria) myszy otrzymały pusty wektor, POD-dynWT, POD-dynL356Q lub POD-dynR725A. Stężenie białka w moczu określono po 12 godzinach od wstrzyknięcia. Każdy pasek reprezentuje co najmniej 10 zwierząt. Ponieważ wymywanie Fc podocytów jest głównie powodowane przez przegrupowanie cytoszkieletu aktyny (23), zbadaliśmy morfologię aktyny w hodowanych podocytach wykazujących ekspresję dynK44A i p40
[podobne: koszt ubezpieczenia zdrowotnego, szpital dziecięcy lublin chodźki, ibum forte ulotka ]
[patrz też: microgynon ulotka, dicortineff ulotka, ibum forte ulotka ]
[przypisy: microgynon ulotka, dicortineff ulotka, ibum forte ulotka ]