Proteolityczne przetwarzanie dynaminy przez cytoplazmatyczną katepsynę L jest mechanizmem białkowo-nerkowej choroby nerek ad 7

Podocyty zakażono przy użyciu adenowirusowego układu ekspresyjnego, który pozwala na ponad 90% skuteczność infekcji. Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu izoformy neuronalnej dyn1 (Figura 6B), jak również dynamicznie eksprymowanej dyn2 (Suplementowa Figura 5). Te dwie izoformy dały identyczne wyniki, co pokazuje, że obserwowane fenotypy w podocytach nie były specyficzne dla izoform (porównaj barwienie F-aktyną w komórkach eksprymujących dynWT i dynK44A na Figurze 6B i Suplementowej Figurze 5). Aktinowa podocyta jest zorganizowana w równoległe wiązki włókien stresowych i korowego pierścienia nitkowatej aktyny (Figura 6B, CON). Ekspresja dynWT nie zmieniła znacząco wzoru barwienia F-aktyny (Figura 6B, WT). Przeciwnie, ekspresja dynK44A lub p40 zniosła naprężenia włókien przy jednoczesnym wzmocnieniu wstęgi korowej aktyny, dając wielokątny kształt komórki (Figura 6B). Podobne fenotypy morfologii aktyny i komórek były związane z LPS (Figura 6B) i terapiami PAN (25). Zatem wystąpienie białkomoczu u myszy eksprymujących dynK44A lub p40 (Figura 6A) koreluje ze zmianami w morfologii podocytów w wyniku zmian w cytoszkielecie aktyny (Figura 6B). Jeśli dynamin jest celem dla CatL, wówczas dynL356Q i dynR725A, które są oporne na cięcie CatL, mogą być korzystne podczas indukowanego przez LPS białkomoczu. W szczytowym białkomoczu (48 godzin po początkowym LPS) myszom wstrzyknięto pusty wektor, dynWT, dynL356Q lub dynR725A albo z promotora CMV (Figura 6C) albo promotor podocyny (Figura 6D), a stopień białkomoczu zanalizowano 12 kilka godzin po wstrzyknięciu DNA. Uderzająco, ekspresja dynR725A doprowadziła do prawie całkowitego ustąpienia białkomoczu, podczas gdy ekspresja dynL356Q zmniejszyła białkomocz o około 50% (Figura 6, C i D, 60-godzinny punkt czasowy). Co ciekawe, podczas gdy CMV-dynWT nie miało wpływu na białkomocz (Figura 6C), ekspresja kierowana przez podocynę zmniejszała białkomocz o 50% (Figura 6D). Zdolność POD-dynWT do przezwyciężenia białkomoczu prawdopodobnie wynika z wyższego poziomu ekspresji dynaminy swoistej dla podocytów oczekiwanej od promotora podocyny. Rzeczywiście, wyciągi z nerek ze zwierząt wykazujących ekspresję POD-dynWT zawierały taki sam poziom dyniny jak ekstrakty ze zwierząt wykazujących ekspresję CMV-dynWT, nawet jeśli ten ostatni był wyrażany we wszystkich typach komórek kłębuszków nerkowych (Figura 5, B i C). Tak więc, podczas gdy ekspresja wysokiego poziomu dynWT może częściowo odwracać wywołane LPS oszołomienie FP, dynL356Q i dynR725A są silniejsze. Co ciekawe, dynR725A jest najpotężniejszym, najprawdopodobniej z powodu przywrócenia optymalnych poziomów komórkowych dynamin: GTP. Dyskusja W tym badaniu badaliśmy rolę proteazy CatL i dużej dynama GTPazy w zdrowych i chorych podocytach nerkowych. Pokazujemy, że dynamin jest zwykle wymagany do utrzymania bariery ultrafiltracyjnej w nerkach, prawdopodobnie poprzez regulację cytoszkieletu aktyny w podocytach. Stosując model myszy do indukowalnej niewydolności nerek, stwierdziliśmy, że rozszczepienie dynaminy przez cytoplazmatyczną postać CatL prowadzi do niepowodzenia podocytów i białkomoczu. Dostarczanie genów opornych na CatL mutantów dynaminowych może zapobiegać, a nawet odwracać białkomocz. Nasze dane definiują nową rolę dla cytoplazmatycznego CatL (trigger) i dynamin (target) w patogenezie białkomoczu kłębuszkowego i otwierają nowe potencjalne możliwości interwencji farmakologicznej w chorobie nerek. Wcześniejsze badania nad inhibitorami sugerowały, że CatL bierze udział w białkowej chorobie nerek (4), a nasz obecny (Rysunek 1D) i poprzednia praca (3) wykazały, że CatL jest zwiększona w modelach gryzoni z powodu nefropatii. Zgodnie z tymi odkryciami, zaobserwowaliśmy wzrost poziomu kłębuszkowego mRNA CatL w wielu ludzkich chorobach białkowych (Figura 1A), które korelowały z dramatycznym wzrostem poziomu białka w kłębuszkach (Figura 1C). Używając myszy z nokautem, dostarczamy ostatecznych dowodów na to, że CatL jest niezbędna do wywoływania nefropatii w odpowiedzi na LPS w modelu myszy (Figura 1, D. F). Ponadto wykazaliśmy, że po leczeniu LPS, CatL pojawia się w cytoplazmie, z powodu ekspresji krótkiej formy białka. Łącznie dane wskazują, że lokalizacja CatL w cytoplazmie stanowi kluczowe wydarzenie w indukcji kłębuszkowej choroby nerek. Zgodnie z tym modelem pokazujemy, że dynamin, białko cytoplazmatyczne, jest niezbędne do funkcjonowania nerek i że jest rozszczepiane przez CatL po leczeniu LPS. Co ważne, fragment Dynamin p40 wytworzony przez cięcie CatL działa jako dominujący negatywny induktor białkomoczu. Zatem aktywność cytoplazmatycznej CatL, w przeciwieństwie do jej odpowiednika lizosomalnego, wydaje się być specyficzna i daje produkt funkcjonalny (p40).
[podobne: badanie psychotechniczne, przygotowanie do rozmowy kwalifikacyjnej, szpital dziecięcy lublin chodźki ]
[podobne: szpital dziecięcy lublin chodźki, emedlink, koszulki ratownik medyczny ]
[podobne: szpital dziecięcy lublin chodźki, emedlink, koszulki ratownik medyczny ]