Proteolityczne przetwarzanie dynaminy przez cytoplazmatyczną katepsynę L jest mechanizmem białkowo-nerkowej choroby nerek ad 9

Linie komórkowe myszy podocytów hodowano jak opisano wcześniej. Przeciwciała Dynamin obejmowały anty-dynaminę (hudy 1) z Upstate Technology; mysz anty-dyn1 5402 firmy Chemicon; VAM-SV041 ze Stressgen. Dwie królicze surowice odpornościowe przeciwko CatL zastosowano w sposób opisany uprzednio (8, 33). CatL. /. fibroblasty utrzymywano w sposób opisany uprzednio (34). Wytworzono stabilne linie komórek knockdown CatL z siRNA opartym na wektorze skierowanym przeciwko CatL (sekwencja docelowa 5a-GTGGACTGTTCTCACGCT-3a). Ilościową reakcję PCR przeprowadzono w systemie PCR Real-Time Applied Biosystems 7300. Zmiany wyrażania fałdów zostały obliczone przy użyciu porównawczej metody CT dla względnej ilościowej z równaniem 2 . CT. Poziomy ekspresji białka dla dynaminy i CatL zostały obliczone na podstawie wyników analizy densytometrycznej z 7 niezależnych eksperymentów z oprogramowaniem Kodak 1D Image Analysis. Istotność statystyczną oceniano za pomocą niesparowanego testu Student z poprawką Welcha. P mniej niż 0,05 uznano za statystycznie istotne. Transfekcje konstruktami CatL przeprowadzono przy użyciu Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Analizę immunocytochemiczną hodowanych podocytów przeprowadzono jak opisano wcześniej (3). Zestaw aktywacyjny BIOMOL CV-CatL / B został wykorzystany zgodnie z instrukcjami producenta. Substrat fluoroforu-krezolowego [CV- (FR) 2] staje się fluorescencyjny po rozszczepieniu CatL / B przyłączonych grup Phe-Arg. Substrat ten łatwo przenika przez błonę komórkową i błony wewnętrznych organelli komórkowych, umożliwiając wykrywanie aktywności katepsyny w żywych podocytach. Znakowanie immunoperoksydazą ludzkiej tkanki przeprowadzono na utrwalonych w formalinie próbkach biopsji nerki zatopionych w parafinie. Transmisyjną mikroskopię elektronową i mikroskopię immunoelektronową przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (35). Frakcjonowanie podkomórkowe przeprowadzono jak opisano (36). Zwierzęta i zabiegi. Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Podkomisję MGH ds. Badań nad zwierzętami. Myszy C57BL / 6 otrzymano z The Jackson Laboratory. CatL. /. myszy były na czystym tle C57BL / 6 (10). Białkomocz indukowany przez LPS modelu mysiego zastosowano jak opisano wcześniej (3). Model szczurzej PAN nerczycowy indukowano w opisany sposób (37). Pacjenci i ilościowa rt-PCR kłębuszkowa. Badano mikrorouszkowe kłębuszki od pacjentów z chorobami białkowo-białkowymi i od osób kontrolnych. Biopsje uzyskano od pacjentów i dawców po uzyskaniu świadomej zgody i za zgodą lokalnych komisji etycznych. W przypadku biopsji kontrolnych tkanka nerki pochodziła z biopsji nerki przed przeszczepem w czasie zimnego niedokrwienia od 7 żywych i dawców zmarłych (n = 8) (38). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą testu Kruskala-Wallisa i testu U Manna-Whitneya. P mniej niż 0,05 uznano za statystycznie istotne. Przetwarzanie dynaminy przez CatL in vitro. Rekombinowaną dynaminę oczyszczono jak opisano wcześniej (39). Jeden mikrogram dynamin (10 pmol) rozcieńczono w buforze zawierającym 200 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7,0, 2 mM EGTA, mM MgCl2 i mM DTT. Gdy wskazano, dodano 200 | jM GTP lub mM GTPyS, a dynamin umożliwiono wiązanie nukleotydów przez 10 minut na lodzie. Reakcję zainicjowano przez dodanie 0,5 .l oczyszczonej CatL (aktywność właściwa 4,13 U / mg białka od Sigma-Aldrich) i próbki umieszczono w 37 ° C w łaźni wodnej na 10 minut. Całkowita objętość testu wynosiła 20. L. Reakcję zakończono dodaniem inhibitora E-64d (Sigma-Aldrich) i buforu do próbek. Do analizy Western blot, 5 ul próbek przeprowadzono na 10% SDS-PAGE. Gdy zastosowano CatB (aktywność właściwa 3,00 U / mg białka od Sigma-Aldrich) lub rekombinowaną ludzką furynę (z R & D Systems), dodano 2 .l enzymów w teście. Infekcje adenowirusowe hodowanych podocytów. Podocyty hodowano do konfluencji 70%. Komórki przemyto dwukrotnie 1X PBS i zakażono 1,2 ml podłoża DMEM bez surowicy zawierającego 100 .l transaktywatora wirusa i 100 .l wirusa eksprymującego dyn1 lub dyn2. Po 2 godzinach infekcji w 37 ° C wirus zawierający podłoże został zastąpiony pełnym DMEM. Jeśli komórki traktowano LPS lub PAN, dodano w tym momencie 50 .g / ml LPS lub 50 .g / ml PAN. Osiemnaście do 24 godzin po zakażeniu komórki odłączano za pomocą trypsyny i albo przetwarzano w celu frakcjonowania subkomórkowego, albo testowano w testach ruchliwości, jak opisano w ref. 3. Gdy wskazano, dodano 20 .M inhibitora specyficznego dla CatL Z-FF-FMK (Calbiochem) jednocześnie z LPS. Wyciągi z nerek. Cztery nerki myszy homogenizowano w buforze zawierającym 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, mM MgCl2, mM PMSF, inhibitory proteinazy, inhibitor kalpainy (Calbiochem) i E-64d z zastosowaniem homogenizatora Dounce.
[podobne: różyczka objawy u dorosłych, jaskółcze ziele zastosowanie, co dziś zjem na śniadanie ]
[więcej w: dieta przy dnie moczanowej tabela, aspargin ulotka, clotrimazolum ulotka ]
[podobne: dieta przy dnie moczanowej tabela, aspargin ulotka, clotrimazolum ulotka ]