Proteolityczne przetwarzanie dynaminy przez cytoplazmatyczną katepsynę L jest mechanizmem białkowo-nerkowej choroby nerek cd

Całkowite białka z rozpuszczalnych frakcji (S) i cząstek (P) analizowano metodą Western blotting. MRNA dla CatL zawiera kilka kodonów AUG (rysunek 2D). Po translacji z pierwszego AUG, CatL jest przetwarzany w celu uzyskania postaci lizosomalnej 30 kDa, zwanej pojedynczym łańcuchem CatL (Figura 2D, czarne strzałki). Jednak alternatywna inicjacja translacji z dalszej części AUG daje izoformę CatL pozbawioną lizosomalnej sekwencji targetowania (zwanej krótką CatL), która lokalizuje się w cytoplazmie (Figura 2D, czerwona strzałka, odnośnik 5). Aby sprawdzić, czy LPS indukuje ekspresję krótkiej CatL, przeprowadzono eksperymenty frakcjonowania subkomórkowego z użyciem hodowanych podocytów. Frakcja cząstek stałych zawiera membrany, w tym lizosomy, podczas gdy frakcja rozpuszczalna reprezentuje cytoplazmę. GAPDH zastosowano jako marker rozpuszczalnych białek cytozolowych i skuteczność lizy. Jak oczekiwano, lizosomalny jednołańcuchowy CatL (30 kDa) był obecny w frakcji cząstek, która zawierała również LAMP-2, CatB i mannozydazę. (Rysunek 2E, linia 2). Traktowanie LPS przez 24 godziny doprowadziło do silnej indukcji krótkiego kotła o masie cząsteczkowej 34 kDa, który był obecny wyłącznie w cytoplazmie (Figura 2E, porównaj ścieżki i 3). Przeciwnie, nie było znaczącego wzrostu ilości formy jednołańcuchowej, LAMP-2 lub mannozydazy. (Rysunek 2E, ścieżki 2 i 4). Ponadto rozpuszczalne frakcje nie były zanieczyszczone białkami jądrowymi, takimi jak czynnik transkrypcyjny Wilms guza (Suplementowa Figura 1E), co wskazuje, że rozpuszczalna krótka postać CatL nie pochodziła z przedziału jądrowego. Co ciekawe, dodanie LPS również indukowało ekspresję 39-kDa pro-CatL, o którym wiadomo, że jest wydzielany (Figura 2E i dodatkowa Figura 1B). Zdolność mRNA CatL do umożliwienia translacji AUG w dół strumienia, a tym samym do wytwarzania cytoplazmatycznej CatL, potwierdzono przez transfekcję CatLc / y. fibroblasty z cDNA, w którym mutagenizowano pierwszy kodon AUG (Dodatkowa Figura 1, F i G, odnośnik 5). Utrata barwienia dynamin w podocytach koreluje z białkomoczem i zależy od CatL. Następnie podjęliśmy próbę identyfikacji celu cytoplazmatycznego CatL. Algorytm oparty na komputerze PEPS (Prediction of Endopeptidase Substrates, ref. 11) zidentyfikował dynaminę GTPazy jako potencjalny substrat CatL (dane nie pokazane). Dynamina jest dużą GTPazą niezbędną do tworzenia pęcherzyków powleczonych klatrą na błonie plazmatycznej (12), a także bierze udział w regulacji dynamiki aktyny w pewnych typach komórek (13). Najpierw zbadano rozkład dynamin w podocytach przy użyciu immunogold EM. Miejsca antygenu Dynamin wykryto w centrum podocytów FP (Figura 3A, lewa, gwiazdka) oraz w obszarach gęstych elektronowo, bogatych w cytoszkielet kory kostnej (Figura 3A, lewa, a). Dodatkowo, wysokoenergetyczny widok dynamin zlokalizowany jest na cytoplazmatycznej stronie pęcherzyków, które są najbardziej prawdopodobnymi jamami pokrytymi klatryną (Figura 3A, prawy, v). Następnie zbadano barwienie dynaminą u myszy przed i po leczeniu LPS. Zgodnie z oczekiwaniami na podstawie danych EM, immunocytochemia u myszy kontrolnych wykryła barwienie dynaminą w kłębuszkach (Figura 3B, lewa strona), w układzie zgodnym z ekspresją podocytu. Dwadzieścia cztery godziny po pojedynczym wstrzyknięciu LPS, znakowanie dynaminem w kłębuszku nerkowym okazało się słabsze i zgrupowane (Figura 3B, środkowy panel), ale pozostało niezmienione w kanalikach (dane nie pokazane). Podobny wzór wybarwiania dynaminami zaobserwowano w modelu szczurzym dla białkowej choroby nerek, w którym zwierzętom wstrzyknięto aminonukleozyd puromycyny (PAN) (Suplementowa Figura 2A, odnośnik 14), co sugeruje, że zmiany w barwieniu kłębuszkowej dyniny są związane z białkomoczem. Co ważne, barwienie dynaminami zachowało się w CatL2 /. myszy leczone LPS (Figura 3B, po prawej). Postawiliśmy hipotezę, że zmiana barwienia dynaminami in vivo jest spowodowana proteolizą przez cytoplazmatyczną CatL. Aby zbadać tę możliwość, DNA kodujące krótką postać CatL lub pre-pro-CatL wstrzyknięto do CatL2 /. myszy stosujące przejściowe dostarczanie genów (15, 16). Oba konstrukty DNA prowadziły do ekspresji kłębuszkowej CatL (Figura 3C, górny rząd). Uderzająco, ekspresja krótkiej CatL specyficznie zmieniła barwienie dynaminą w sposób podobny do obserwowanego w przypadku LPS (Figura 3C, dolny rząd). Wraz z faktem, że dynamin jest substratem CatL in vitro (patrz poniżej), dane te są zgodne z rozszczepieniem dynaminy przez CatL w nerkach po traktowaniu LPS. Ponieważ izolowane kłębuszki od zwierząt zawierają również inne rezydentne komórki, określiliśmy ilościowo ilość dynamin przed i po traktowaniu LPS przy użyciu hodowanych podocytów. Analiza Western blot lizatów podocytów wykazała około 30% spadek ilości endogennej dynaminy po leczeniu LPS (fig. 3, D i E)
[podobne: dieta przy dnie moczanowej tabela, emedlink, piramida zdrowego zywienia ]
[patrz też: koszulki ratownictwo medyczne, tobrosopt dex, koprolalia ]
[więcej w: koszulki ratownictwo medyczne, tobrosopt dex, koprolalia ]