Proteolityczne przetwarzanie dynaminy przez cytoplazmatyczną katepsynę L jest mechanizmem białkowo-nerkowej choroby nerek czesc 4

Zmniejszenie liczby dynamin było zależne od CatL, ponieważ nie wystąpiło, gdy CatL został zmniejszony za pomocą siRNA. Łącznie dane te sugerują, że cytoplazmatyczny CatL celuje w dynamin w modelach białkowych gryzoni. Figura 3 Wyrównane barwienie dynaminą w kłębuszku po traktowaniu LPS jest zależne od CatL. (A) Immunogoldowa analiza dynamin w podocytowych FP kłębuszków szczurów. Widok niskiej mocy (po lewej) przedstawia dynamin w centrum podocytów FP (gwiazdka), jak również w gęstych elektronowo obszarach bogatych w aktynę korową (a) (oryginalne powiększenie, × 30 000). Widok wysokiej mocy pokazuje cząsteczki złota, które są związane z cytoplazmatyczną stroną pęcherzyków (v) oraz z obszarami aktyny gęstymi elektronami (a) (oryginalne powiększenie × 45 000). E, endosom; GBM, błona podstawna kłębuszkowa; Ly, lizosom; SD, membrana szczelinowa; USA, przestrzeń moczowa. (B) Immunocytochemia dynamin w kłębuszkach myszy WT przed i po wstrzyknięciu LPS i CatL2 /. myszy po wstrzyknięciu LPS. (C) Immunocytochemia próbek z CatLa /. myszy dla dynamin kłębuszkowych i CatL. CatL. /. myszy zostały zrekonstytuowane z Pre-Pro-CatL (po lewej) lub z krótkim CatL (po prawej) przy użyciu przejściowego transferu genów. Dwadzieścia cztery godziny po przeniesieniu genu kłębuszki barwiono stosując przeciwciało anty-CatL i anty-dynamina hudy 1. Oryginalne powiększenie, × 400 (B i C). (D) Immunoblot endogennej dynaminy w hodowanych podocytach w odpowiedzi na LPS. Rekombinowana dynaminę (REC), ekstrakty WT i CatLa /. podocytów, były analizowane. (E) Ocena ilościowa dynaminy w ekstraktach komórkowych pokazana w D. Sygnał Dynamina został dostosowany do poziomów aktyny. CatL rozszczepia dynaminę: GTP in vitro i in vivo. Jeśli dynamin jest celem CatL w cytoplazmie, wówczas rekombinowana dynamin powinna być odszczepialna przez CatL w neutralnym pH. Algorytm PEPS zidentyfikował potencjalną sekwencję rozpoznawaną (ELSGGA) w obrębie dynaminy między aminokwasami 354 i 359. Interesujące jest, że motyw ELSGGA jest wysoce konserwatywny wśród wielu gatunków (Figura 4A). CatL nie spowodował znaczącego rozszczepienia dynaminy przy pH 7,0 (Figura 4C, porównaj ścieżki i 2). Uderzająco, dodanie GTP spowodowało wytworzenie znaczącego fragmentu proteolitycznego o masie cząsteczkowej około 40 kDa (p40) (Figura 4C, ścieżka 3). p40 to przewidywana wielkość fragmentu N-końcowego po cięciu w sekwencji ELSGGA (Figura 4A). Inny fragment, p55, obserwuje się w nieobecności dodanej proteazy (Figura 4C, ścieżka 1). Zatem p55 nie jest prekursorem p40. Ponadto, inkubacja dynaminy z CatB generowała p55 w sposób niezależny od nukleotydu (Figura 4C, ścieżki 5. 8), podczas gdy folia- na proteaza nie była zdolna do rozszczepiania dyniny (Figura 4C, ścieżki 9. 12). Tak więc, podczas gdy p55 jest wytwarzany przez szereg proteaz, a zatem stanowi. Gorący punkt. do proteolizy (17), p40 jest generowany przez CatL tylko wtedy, gdy dynamin jest w konformacji związanej z GTP. Interesujące jest, że dodanie GTPyS (niehydrolizowalnego analogu GTP) nie stymulowało cięcia przez CatL (Figura 4C, ścieżka 4). Te dane można wyjaśnić w kategoriach statusu oligomeryzacji dynamin. W stanie podstawowym dynamin jest homotetramerem, który może się samoczynnie łączyć w pierścienie lub spirale, gdy jest związany z GTP (Figura 4B). Te struktury dynamin wyższego rzędu wykazują podwyższoną aktywność GTPazy, która z kolei napędza ich demontaż. GTP . S stabilizuje oligomeryzowaną dynaminę w wyniku hamowania hydrolizy GTP (18). Oligomeryzacja dynaminowa jest mediowana przez domenę środkową i GAP dynaminy (19), i na podstawie rekonstrukcji krio-EM złożonej dynaminy (20), przewiduje się, że aminokwasy ELSGGA (zlokalizowane w środkowej domenie) będą niedostępne, gdy dynamin jest samo -zmontowany (Figura 4B). Aby przetestować pomysł, że samodzielna kompozycja dynamin chroni przed cięciem CatL, przeprowadziliśmy dodatkowe eksperymenty cięcia w kwaśnym pH, gdzie CatL jest bardziej aktywny. Przy pH 5,0 i 6,0, CatL był wysoce reaktywny wobec rekombinowanej dynaminy, nawet w nieobecności GTP (Figura 4D, ścieżki 2 i 4). Uderzająco, tę proteolizę zahamowano przez dodanie GTPyS (Figura 4D, ścieżki 3 i 5). Łącznie nasze dane są zgodne z hipotezą, że główne miejsce rozpoznawane przez CatL znajduje się w domenie, która staje się niedostępna po samodzielnym złożeniu dynamin. Rycina 4 Wpływ stanu związanego z nukleotydem i wiązania dynaminy na rozszczepianie CatL in vitro i in vivo. (A) Struktura domenowa dynaminy, odpowiednich przeciwciał i sekwencji aminokwasowej przewidywanych miejsc cięcia CatL. Należy zauważyć, że sekwencja ELSGGA jest wysoce konserwatywnym motywem w całym gatunku. PH, domena homologii pleckstrinu; PRD, bogata w prolinę-argininę; Shi, homolog Dynamin w Drosophila; Vsp1, homolog dynaminowy w drożdżach
[przypisy: typy osobowości wg junga, colgate max white one active, przygotowanie do rozmowy kwalifikacyjnej ]
[przypisy: sebidin plus, koszulka ratownictwo medyczne, jaskółcze ziele zastosowanie ]
[patrz też: sebidin plus, koszulka ratownictwo medyczne, jaskółcze ziele zastosowanie ]