ROS generowane przez pyłek oksydazy NADPH dostarczają sygnału, który zwiększa indukowane antygenem alergiczne zapalenie dróg oddechowych ad 10

Myszy naiwne i uczulone na RWE (BALB / c, NOD SCID lub C57BL / 6) poddano prowokacji RWE (100 .g), a płyny BAL zebrano po 30 minutach. Płyny BAL sklarowano przez odwirowanie (956 g przez 10 minut w 4 ° C), a próbki przechowywano w temperaturze <80 ° C. Dodano butylowany hydroksytoluen (0,5 mM, Sigma-Aldrich), aby zapobiec dalszemu utlenianiu lipidów w niektórych porcjach. Poziomy GSSG mierzono spektrofotometrycznie przy 412 nm, stosując zestaw glutation / GSSG-412 (Bioxytech; OXIS). MDA i 4-HNE oznaczono ilościowo przy użyciu zestawu do oznaczeń LPO-586 (OXIS) i zmierzono absorbancję przy 580 nm. Ocena ilościowa cytokin. Supernatanty komórek splenocytów badano za pomocą 2-miejscowego testu immunoenzymetrycznego dla IL-4 (klony 1D11 i 24G2, Pierce Biotechnology Inc.), IL-5 (klony TRFK5 i TRFK4, BD Biosciences. Pharmingen) i IL-13 (klon 38213 i nr katalogowy BAF413; R & D Systems). IL-8 w supernatancie hodowli A549 zmierzono za pomocą 2-miejscowego testu immunoenzymetrycznego dla IL-8, stosując zestaw ELISA (nr katalogowy KHC0081, Biosource International). Oznaczanie morfometryczne eozynofili okołoprotonowych. Krioskrawki unieruchomionych OCT. Płuca inkubowano z króliczym anty-mysim głównym białkiem eozynofilowym (anty-MBP, hojny prezent od GJ Gleich, Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, USA) lub normalną surowicą króliczą, a następnie z kozim anty-króliczym Alexa Fluor sprzężone przeciwciało 488 (Invitrogen Corp.). Zabarwione sekcje sfotografowano za pomocą cyfrowej kamery Photometrix CoolSNAP Fx CCD zamontowanej na mikroskopie fluorescencyjnym Nikon Eclipse TE 200. Wykonano analizy morfometryczne w celu ilościowego oznaczenia liczby i obszaru eozynofili przy użyciu oprogramowania MetaMorph (wersja 5, Universal Imaging Corp.). Pięć do sześciu obrazów z 5 różnych poziomów na płuco (n = 3 zwierzęta na grupę) uzyskano i ponownie zmontowano przy użyciu algorytmu sztafetowania etapów montażu oprogramowania MetaMorph (78). Zintegrowaną funkcję analizy morfometrycznej użyto do przekształcenia całkowitego obszaru pikselowego sygnału fluorescencyjnego z eozynofili w jednostki m22 po kalibracji (79). Dane przedstawiono jako obszar eozynofili (sygnał fluorescencyjny) w. M2 na milimetr całkowitego obszaru okołooskrzelowego. Wytwarzanie mucyny w komórkach nabłonkowych oceniano za pomocą okresowego barwienia kwasem-Schiffa utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie przekrojów płuc i oznaczano ilościowo za pomocą oprogramowania MetaMorph, jak opisano powyżej. Test podwójnej lucyferazy. Komórki A549 hodowano w 24-studzienkowych płytkach do 70% konfluencji i przejściowo kotransfekowano z plazmidem reporterowym IL-8 lucyferazy (hojny prezent od AR Brasier, UTMB, Galveston, Texas, USA) i plazmidami lucyferazy renegi (Promega) w plazmidzie phRL-TK Renilla w stosunku 10: 1. Dwanaście godzin po transfekcji komórki traktowano PBS, 250 nM 4-HNE lub 5 mM GSSG rozpuszczonym w PBS. Aktywności lucyferazy mierzono za pomocą systemu podwójnej analizy lucyferazy (Promega) zgodnie z zaleceniami producenta. Pokrótce, trzykrotne próbki zawierające po 1,5 x 105 komórek poddano lizie z użyciem 100 ul buforu do lizy (podwójny zestaw lucyferazy, Promega) 12 godzin po traktowaniu. Szczątki komórkowe usunięto z supernatantów przez odwirowanie. Porcje 20. L supernatantów dodano do roztworu substratu lucyferazy Renilla i Firefly, a ilość światła emitowanego przez próbkę zmierzono za pomocą Luminometru Lucy2 (Anthos Labtec Instruments GmbH). Wyniki to środki. SEM znormalizowanego wzrostu procentowego (n = 3). Oznaczanie ilościowe IgE swoistej dla pRWE. IgE swoiste dla pRWE mierzono w próbkach surowicy za pomocą 1-miejscowego testu immunoenzymetrycznego. W skrócie, studzienki do mikromiareczkowania powlekano pRWE i sondowano biotyną przeciw mysiemu IgE (R35-72; BD Biosciences . Pharmingen). Płytki wytworzono z użyciem enzymu awidyna-fosfataza alkaliczna (Sigma-Aldrich) i substratu pNPP (Sigma-Aldrich). Statystyka. Dane z różnych badanych grup analizowano za pomocą ANOVA, a następnie analizy post-hoc Bonferroni dla najmniej znaczącej różnicy. Różnice uznano za znaczące przy P <0,05. Podziękowania Wyrażamy uznanie BK Sur za jego fachową wiedzę w zakresie przeciwutleniaczy, A. Estrada za przyczynienie się do ilościowego oznaczania mucyny za pomocą analiz morfometrycznych, oraz D. Konkel za krytyczne przeczytanie manuskryptu. Badania zostały wsparte przez grant Narodowego Instytutu Środowiska i Nauk Środowiskowych (ES06676, I. Boldogh), NIH przyznaje 1R01HL071163-01A2 i P01 AI46004 (na S. Sur) i CA84461 (na I. Boldogh), Narodowe Serce, Lung i Inicjatywa Proteomiki Instytutu Krwi (N01-HV28184, A. Kurosky i S. Sur) oraz grant pilotażowy projektu UTMB (dla S. Sur). Przypisy Patrz odnośny komentarz od strony 2067. Istvan Boldogh, Attila Bacsi, Barun K Choudhury i Nilesh Dharajiya w równym stopniu przyczynili się do tej pracy. Zastosowano niestandardowe skróty: AHR, nadreaktywność dróg oddechowych; BAL, płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe; DCF, dichlorofluoresceina; DPI, difenylenodion; GSSG, utleniony glutation; Dioktan H2DCF-DA, 2 -7P-dihydro-dichlorofluoresceiny; HDM, roztocza kurzu domowego; 4-HNE, 4-hydroksynonenal; MDA, aldehyd malonowy; MDCK, nerka Madin-Darby; NAC, N-acetylocysteina; NBT, nitroblue tetrazolium; NCI, National Cancer Institute; Komórka NHBE, normalna ludzka komórka nabłonka oskrzeli; O2., Anion (y) rodnikowy ponadtlenkowy; PCBER, reduktaza z eteru fenylo-arganowego benzylowego; pRWE, oczyszczony RWE; pRWEOX +, frakcje pRWE o aktywności oksydazy NADPH; pRWEOX ., frakcje pRWE bez aktywności oksydazy NADPH; QA, chinianryna; RWE, ekstrakt z pyłku ambrozji; RWEH, inaktywowany termicznie RWE; SOD, dysmutaza ponadtlenkowa; XO, oksydaza ksantynowa; X + XO, ksantyna i XO. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. [patrz też: twardzina układowa objawy, microgynon ulotka, dicortineff ulotka ] [patrz też: debutir ulotka, microgynon ulotka, dicortineff ulotka ] [podobne: debutir ulotka, microgynon ulotka, dicortineff ulotka ]