ROS generowane przez pyłek oksydazy NADPH dostarczają sygnału, który zwiększa indukowane antygenem alergiczne zapalenie dróg oddechowych ad 8

W tym modelu uszkodzone lub zestresowane tkanki generują czynniki, które aktywują komórki prezentujące antygen. Ostatnio zaproponowano, że wewnętrzne proteazy w HDM indukują sygnał niebezpieczeństwa. ułatwia uczulenie na antygeny roztoczy (71). Badanie, czy indukcja ROS przez pyłki oksydazy NADPH stanowi sygnał niebezpieczeństwa, jest potrzebne. W obecnym badaniu wykazaliśmy, że oksydaza pyłku NADPH może indukować specyficzną produkcję IgE. Następnie wykazaliśmy, że 39 z 40 badanych ekstraktów pyłkowych miało wykrywalną aktywność redoks. Jedynym ekstraktem z pyłku, który nie wykazał aktywności redoks był sosna. To stwierdzenie jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami, że nawet jeśli pyłki sosny są obecne w dużych ilościach w środowisku, nie wywołują alergicznego uczulenia u ludzi (72, 73). Nasze wyniki sugerują, że specyficzne inhibitory oksydazy pyłku NADPH mogą zapobiegać alergicznemu zapaleniu dróg oddechowych. Jednak znaczenie naszego badania dla ludzkiej astmy pozostaje nieistotne, a obserwowany mechanizm musi zostać ustalony u pacjentów z chorobą atopową. Metody RWE. RWE (wolna od endotoksyn) (partia XP56-D18-1320) zakupiono w Greer Laboratories. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono z ambrozją, ponieważ jest alergenem istotnym dla ludzkiej astmy alergicznej. Wcześniej wykazaliśmy, że pacjenci z astmą alergiczną poddani prowokacji subsegmentowo z RWE i innymi alergenami wzmagają późne zapalenie dróg oddechowych, które jest głównie neutrofilowe lub eozynofilowe, w zależności od ilości endotoksyny w wyciągu alergennym (74). Ponieważ astma jest chorobą eozynofilową dróg oddechowych, w obecnym badaniu stosowaliśmy RWE bez endotoksyn. Kultury komórkowe i metody leczenia. Komórki otrzymano z ATCC (A549, NCI-H292 i MDCK) i utrzymywano zgodnie z instrukcjami dostawcy. Komórki NHBE otrzymano z Cambrex Bioproducts (nr katalogowy CC-2641, seria nr 3F0404) i hodowano na 12-studzienkowych membranach transwell powleczonych kolagenem (wielkość porów 0,4 urn, Corning Costar). Interfejs powietrze-ciecz ustalono, gdy komórki osiągnęły konfluencję w kulturze, jak opisano wcześniej (45, 75). Komórki utrzymywano w nawilżonym CO2 (5%) inkubatorze i pożywce zgodnie z zaleceniami dostawców. W celu wykrycia fosforylacji p38 MAPK, komórki 2 x 105 A549 hodowano na studzienkę przez 12 godzin i przemyto PBS. Komórki głodzono w pożywce bez surowicy przez 4 godziny, a następnie traktowano PBS, 5 mM GSSG lub 250 nM 4-HNE przez 5-60 minut. Natychmiast po inkubacji komórki poddano lizie i zastosowano do analizy Western blot. Splenocyty inkubowano przy 5 x 106 komórek / ml z rozcieńczalnikiem lub alergennymi ekstraktami (100 ug / ml) przez 4 dni. Komórki inkubowano w kompletnej pożywce, jak wspomniano powyżej. Zwierzęta, sensytyzacja i wyzwanie. Eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z Przewodnikiem NIH dla opieki i użytkowania zwierząt doświadczalnych i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami UTMB (zatwierdzenie nr 97-08-038). W badaniach tych wykorzystano 6 do 8-tygodniowe samice myszy BALB / c, C57BL / 6 WT, C57BL / 6J-KitWv, NOD WT i NOD SCID zakupione z Harlana lub The Jackson Laboratory. Zapalenie dróg oddechowych wywołano uczuleniem i wyzwaniami RWE (Greer Laboratories) (5, 6, 10). W skrócie, myszy uczulano raz 150 .g / mysz RWE zmieszano z ałunem (dzień 0) i ponownie 4 dni później (dzień 4), jak opisano wcześniej (6, 9). W dniu 11 równoległe grupy myszy poddano donosowo prowokacji RWE (100 .g), RWEH (100 .g) lub Amb a (10 .g). W wybranych eksperymentach ksantynę (0,32 mM) i XO (50 mU, Sigma-Aldrich) zmieszano z RWEH lub Amb a 1. W niektórych eksperymentach myszy prowokowano za pomocą 12. M GSSG lub 75. M 4-HNE na mysz lub w połączeniu z Amb a 1. Ocena alergicznego zapalenia. Naciekanie komórek do światła dróg oddechowych oceniono na podstawie analizy płynu BAL po 72 godzinach od prowokacji, jak opisaliśmy wcześniej (5, 6, 10, 58). Test NBT. Ekstrakt z ziarna pyłku białkowego (50 .g / test) zmieszano z NBT (2 .M) z lub bez NADPH (100 .M). Mieszaniny inkubowano następnie przez 15 minut w 37 ° C, a formazan osadu rozpuszczono w metanolu. Oznaczono OD przy 530 nm w spektrofotometrze (DU 530, Beckman Coulter). Test NBT na żelu in situ. Ekstrakty alergenów (50 .g na ścieżkę) poddawano elektroforezie w 6% nieoddarzającym się żelu poliakrylamidowym w temperaturze 4 ° C. Żel zanurzono w roztworze NBT (2 mM) i dodano NADPH (1 mM). Żel został sfotografowany po opracowaniu koloru. Analiza Western blot. Białka rozdzielono na 10% żelu SDS-poliakryloamidowym i przeniesiono na membrany Hybond (Amersham Biosciences)
[podobne: street workout plan treningowy, twardzina układowa objawy, czy kawa podnosi ciśnienie ]
[przypisy: koprolalia, sebidin plus, koszulka ratownictwo medyczne ]
[przypisy: koprolalia, sebidin plus, koszulka ratownictwo medyczne ]