ROS generowane przez pyłek oksydazy NADPH dostarczają sygnału, który zwiększa indukowane antygenem alergiczne zapalenie dróg oddechowych ad 9

Błony inkubowano w buforze blokującym zawierającym 5% BSA w buforze TBST (20 mM Tris-zasada, 137 mM NaCl, pH 7,6 i 0,05% Tween 20) przez godzinę, a następnie inkubowano w pierwszorzędowym Ab (królicze poliklonalne przeciwciało ludzki p67phox, nr katalogowy SC-15342, Santa Cruz Biotechnology Inc.) przez godzinę. Alternatywnie, w przypadku analizy p38 MAPK, zastosowano oczyszczony przez powinowactwo królicze poliklonalne Ab wobec ufosforylowanego p38 MAPK (New England Biolabs). Po przemyciu 5 razy w buforze TBST, bloty inkubowano przez 30 minut ze sprzężonym z HRP drugorzędowym Ab (osiołowe przeciwciało przeciw-królicze skoniugowane z HRP, nr katalogowy NA 934, Amersham Biosciences). Bloty opracowano z użyciem ulepszonego substratu chemiluminescencji (ECL; Amersham Biosciences) zgodnie z protokołem producenta. Badania immunofluorescencji. W celu immunolokalizacji oksydazy NADPH, kriosekacje ziaren pyłku utrwalono acetonem / metanolem (1: 1) i inkubowano z p67phox anty-ludzkim przez 30 minut w 37 ° C. Po 3 przemyciach PBS-Tween 20 dodano anty-królicze skoniugowane z FITC przeciwciało IgG (nr katalogowy SC-2359, Santa Cruz Biotechnology Inc.) i inkubowano jak opisano powyżej. Fragmenty zamontowane w roztworze przeciwzmarszczkowym (fluorescencyjne medium montażowe, nr katalogowy S3023, DAKO Inc.) zbadano przy użyciu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego Nikon Eclipse TE 200 przymocowanego do aparatu cyfrowego Photometrix CoolSNAP Fx CCD i oprogramowania MetaMorph (wersja 5, Universal Imaging Corp .). Oznaczenie cytochromu c. W celu wykrycia O2a, zastosowano test cytochromu c, jak opisano w Messner i Imaly (44). Test przeprowadzono w PBS z 10 .g pRWE i 10 .M utlenionego cytochromu cw mieszaninie reakcyjnej. Reakcję rozpoczęto przez dodanie 100. M NADPH i rejestrowano wzrost A550 nm przez 5 minut. Nasycające ilości SOD (50 U / ml) zastosowano w reakcji referencyjnej dla określenia dowolnej niezależnej od O2. Niezależnej bezpośredniej redukcji cytochromu c przez próbkę. Pomiar aktywności szczawianu, aminy, glukozy i XO. Zastosowano test Amplex Red (10-acetylo-3,7-dihydroksyfenoksazyny; Invitrogen Corp.) w celu określenia aktywności oksydazy według protokołu producenta. Amplex Red reaguje z H2O2 w obecności HRP, aby wytworzyć stabilny produkt, resorufin (76). Pokrótce, frakcje RWE (100 .g / ml) zawieszono w 100 .l buforu do reakcji, a następnie inkubowano w temperaturze pokojowej (25 ° C) przez 30 minut z 0,25 U / ml czerwieni Amplex (określonej w badaniach wstępnych) i U / ml. ml HRP. Zmianę fluorescencji mierzono za pomocą czytnika mikropłytek (SpectraMass M2, Molecular Devices). Reakcje przeprowadzono z lub bez egzogennie dodanego SOD. Dodanie katalazy (400 U / ml, Sigma-Aldrich) zmniejszyło poziomy H2O2 o około 90%. Pomiar ROS w hodowanych komórkach nabłonka. Komórki (A549, NCI-H292, NHBE i MDCK) hodowane do konfluencji 70% obciążono 50 .M H2DCF-DA w 37 ° C przez 15 minut. Alternatywnie, komórki NHBE hodowane w interfazie powietrze-ciecz obciążono 50 .M H2DCF-DA w 37 ° C przez 15 minut od powierzchni boczno-bocznej. Po usunięciu nadmiaru sond, komórki traktowano RWE z lub bez NADPH (100 .M) i z lub bez inhibitorów oksydazy NADPH QA (500 .M) i DPI (100 .M). W wybranych eksperymentach dodano koktajl inhibitora proteazy roślinnej w rozcieńczeniu 1: 100 (nr P2714, Sigma-Aldrich). Ten koktajl inhibitora proteazy zawierał następujące składniki: 2 mM inhibitor 4- proteazy serynowej, mM EDTA (inhibitor metaloproteazy), 130 .M bestatyny (inhibitor aminopeptydazy), 14 .M E-64 (inhibitor proteazy cysteiny), .M leupeptyny (inhibitor proteazy serynowej i cysteinowej) i 0,3 .M aprotyniny (inhibitor proteazy serynowej). Zmianę intensywności fluorescencji oceniano w czytniku mikropłytek FLx800 (Bio-Tek) lub w wybranych eksperymentach za pomocą cytometrii przepływowej (FACScan, BD Biosciences) (77) przy wzbudzeniu 488 nm i emisji 530 nm. Każdy punkt danych analizy FACS reprezentuje średnią fluorescencję dla 12 000 komórek z 3 lub więcej niezależnych eksperymentów i wyraża się jako. SEM. Pomiar ROS w nabłonku dróg oddechowych ex vivo. Myszy uczulano na RWE, a w dniu 11 nabłonek dróg oddechowych obciążano przez dopłucne podawanie chlorometylo-H2DCF-DA (Invitrogen Corp.) lub NBT (Invitrogen Corp.). Po usunięciu nadmiaru sondy, płuca prowokowano RWE (100 .g) ex vivo. Środowiskowe RWE usunięto 15 minut po prowokacji. Następnie płuca napompowano i osadzono w Optycznej Temperaturze Skrawania (OCT, Sakura Finetek), zamrożono i podzielono na sekcje. Utlenione produkty wrażliwych na redoks sond analizowano za pomocą kamery cyfrowej Photometrix CoolSNAP Fx CCD zamontowanej na mikroskopie fluorescencyjnym Nikon Eclipse TE 200. Pomiar GSSG, MDA i 4-HNE
[więcej w: aulin ulotka, czy kawa podnosi ciśnienie, różyczka objawy u dorosłych ]
[hasła pokrewne: jaskółcze ziele zastosowanie, aulin ulotka, przeziernosc karkowa ]
[patrz też: jaskółcze ziele zastosowanie, aulin ulotka, przeziernosc karkowa ]