ROS generowane przez pyłek oksydazy NADPH dostarczają sygnału, który zwiększa indukowane antygenem alergiczne zapalenie dróg oddechowych ad

Nasze dane wskazują, że stres oksydacyjny indukowany oksydazą NADPH odgrywa kluczową rolę w ułatwianiu alergicznego zapalenia dróg oddechowych wywołanego antygenem pyłkowym. Wyniki Wszystkie badane pyłki mają wewnętrzną aktywność oksydazy NADPH. Komórki z różnych gatunków roślin zawierają oksydazy, które generują ROS i regulują ważne funkcje fizjologiczne, takie jak kiełkowanie nasion i wzrost włosów korzeniowych (32, 33). Analogicznie stwierdziliśmy, że kiełkowanie pyłku prawdopodobnie będzie wymagać ROS generowanych przez te oksydazy podczas procesów zapylania. Zastosowaliśmy test nitroblue tetrazolium (NBT) w celu ustalenia, czy ekstrakt z ambrozji (Ambrosia artemisiifolia) generuje ROS. RWE w roztworze zredukowało wrażliwy na redoks NBT do formazanu (34) (Figura 1A). Dodanie NADPH do rozwiązania RWE zwiększyło jego zdolność do redukcji NBT (rysunek 1A). Dezaktywowane termicznie RWE (RWEH) i Amba 1, główne białko antygenowe w RWE (35), nie zmniejszyły NBT. W celu zidentyfikowania składnika redukującego NBT, frakcjonowaliśmy surową RWE metodą chromatografii Superdex 200 (Amersham Biosciences). Wszystkie 120 frakcji (po ml każda) przebadano pod kątem testu NBT, a oczyszczone frakcje RWE (pRWE) o aktywności oksydazy NADPH (pRWEOX +), jak również te bez (pRWEOXa) przechowywano w temperaturze <80 ° C. Zbadaliśmy również zdolność tych frakcji do utleniania dioctanu 2- [3- (3-dihydro-dichlorofluoresceiny wrażliwego na redukcję redox (H2DCF-DA) do fluorescencyjnej dichlorofluoresceiny (DCF). Zgodnie z oczekiwaniami, frakcje pRWEOX + przekształciły H2DCF-DA w DCF, ale pRWEOX. frakcje nie udało się to zrobić (dane nie przedstawione). Zdolność pRWEOX + do redukcji NBT została zablokowana przez dysmutazę ponadtlenkową (SOD) i przez inhibitory oksydazy NADPH difenylotiodon (DPI) i chinukrynę (QA) (21) (Figura 1B), co sugeruje, że oksydaza NADPH jest głównym źródłem ROS. Rośliny mają proteazy i różnorodne oksydazy, takie jak oksydaza szczawianowa, oksydaza aminowa, oksydaza ksantynowa (XO) i oksydaza glukozowa (31, 36. 41). Jednakże nie znaleźliśmy wykrywalnej aktywności tych enzymów we frakcjach RWE (dane nie pokazane). Obserwacje te sugerują, że aktywność redukująca NBT we frakcjach RWE jest spowodowana oksydazą NADPH, a nie innymi enzymami. Figura Wyciągi z ziaren puchu przedstawiają aktywność oksydazy NADPH. (A) Redukcja NBT do formazanu przez ekstrakty alergenowe z zastosowaniem testu NBT w obecności (+) lub nieobecności (.) NADPH. Testowano RWE, RWEH i Amb a 1. X + XO zastosowano jako kontrolę pozytywną. P <0,001; P <0,0001. (B) indukowana przez pRWEOX + redukcja NBT jest hamowana przez inhibitory oksydazy NADPH DPI, QA i SOD. Wskazano obecność lub brak NADPH w mieszaninie reakcyjnej. (C) Redukcja NBT za pomocą alergennych ekstraktów in situ po PAGE nie uwalniającym. Pokazano RWEH, dezaktywowany termicznie ekstrakt dębu (OakH) i dezaktywowany ciepłem ekstrakt z trawy tymotki (TimothyH). (D) Wykrywanie p67phox za pomocą analizy Western blot przy użyciu króliczego przeciwciała przeciwko ludzkiemu p67phox. (E i F) Immunolokalizacja p67phox w pyłku ambrozji wykryta za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu przeciwciała anty-p67phox (E) lub normalnej kontroli IgG królika (F). Prawe panele pokazują różnice interferencyjne obrazów kontrastowych tych samych pyłków. Powiększenie, × 600. (G) Kinetyka O2 generacja określona za pomocą testu cytochrom c. Pokazano cytochrom c (wypełnione diamenty); cytochrom c plus pRWEOX + (wypełnione kwadraty); cytochrom c plus NADPH (otwarte trójkąty); cytochrom c plus pRWEOX + i NADPH (puste kwadraty); i cytochrom c plus pRWEOX +, NADPH i SOD (wypełnione trójkąty). Aby potwierdzić te obserwacje, przeprowadziliśmy test NBT in situ na natywnych białkach ekstraktu po niedodawaniu PAGE (42). Dodanie NADPH do buforu reakcyjnego w teście szybko indukowało dobrze zdefiniowane pasma białkowe redukujące NBT w ścieżkach z RWE i innymi ekstraktami pyłkowymi (Figura 1C). Obróbka cieplna ekstraktów unieważniła tę aktywność (rysunek 1C). Ponadto, ekstrakty alergenowe pyłku z 38 innych chwastów, traw i drzew indukowały utlenianie H2DCF-DA do fluorescencyjnego DCF (Tabela 1). Odkrycia te wskazują, że alergenowe ekstrakty chwastów, drzew i traw mają wewnętrzną aktywność oksydazy NADPH. Tabela 1. Aktywność ekstraktów roślinnych z pyłku roślinnego Aby potwierdzić obecność oksydazy NADPH w ekstraktach pyłkowych, przeprowadziliśmy analizy immunoblottingu i immunohistochemii przy użyciu przeciwciała przeciw składnikowi p67phox ludzkiej oksydazy NADPH, który reaguje krzyżowo z białkami pokrewnymi oksydazie roślinnej NADPH (43). Analiza Western blot zidentyfikowała pojedyncze pasmo w RWE i pRWEOX +, ale nie w pRWEOX. (Figura 1D). To przeciwciało reagowało z regionem periplazmatycznym uwodnionych ziaren pyłku o przekroju poprzecznym z ambrozją (fig. 1, E i F). Redukcja NBT przez RWE i pRWEOX + (ryc. 1B) sugeruje, że generują ponadtlenkowe rodniki anionowe (O2 ) [hasła pokrewne: koszt ubezpieczenia zdrowotnego, colgate max white one active, emedlink ] [więcej w: aulin ulotka, przeziernosc karkowa, debutir ulotka ] [przypisy: aulin ulotka, przeziernosc karkowa, debutir ulotka ]