ROS generowane przez pyłek oksydazy NADPH dostarczają sygnału, który zwiększa indukowane antygenem alergiczne zapalenie dróg oddechowych cd

Do potwierdzenia tej obserwacji wykorzystaliśmy test cytochromowy c. W obecności NADPH, pRWEOX + zmniejszył poziom cytochromu c, a redukcja ta została zniesiona przez SOD (Figura 1G). Te wyniki wskazują, że oksydazy pyłku NADPH wytwarzają O2 .; proces ten jest wrażliwy na inhibitory oksydazy NADPH i obróbkę cieplną. Oksydazy NADPH pyłkowe indukują stres oksydacyjny w hodowanych komórkach nabłonka. W oparciu o nasze początkowe odkrycie obecności O2. – generowania oksydaz NADPH w pyłach, zbadaliśmy wpływ ekstraktów pyłkowych na hodowane komórki nabłonka. Wyciągi z pyłku trawy RWE i drzewa pecan i tymotki łąkowej szybko przekształcają wewnątrzkomórkowe wrażliwe na redoks H2DCF-DA w hodowanych komórkach nabłonka oskrzeli A549 w fluorescencyjny DCF (Figura 2A). Dodanie nadmiaru NADPH do ekstraktów pyłkowych dodatkowo zwiększyło wewnątrzkomórkowe poziomy ROS; efekt ten był tłumiony przez inhibitory oksydazy NADPH QA i DPI. Dodatek ekstraktów i białek antygenowych pozbawionych aktywności oksydazy NADPH. takie jak RWEH, Amb a i pRWEOX. . nie zwiększyło wewnątrzkomórkowych poziomów ROS w hodowanych komórkach (Figura 2A). Przeciwnie, bogaty w OSTADPH oksydazę pRWEOX + zwiększał poziomy ROS w komórkach A549 (Figura 2A). Ponadto, RWE był tak samo skuteczny jak generator ponadtlenkowy ksantyny i XO (X + XO) w zwiększaniu wewnątrzkomórkowych poziomów ROS w nabłonkowych komórkach NCI (NCI-H292) pochodzących z płuc, normalnych ludzkich komórkach nabłonka oskrzeli (komórki NHBE), i komórki nabłonkowe nerki Madin-Darby (MDCK) (Figura 2B). Ten wzrost wewnątrzkomórkowej ROS był hamowany przez wstępne traktowanie komórek środkiem neutralizującym ROS N-acetylocysteiną (NAC) (Figura 2B). RWE było równie skuteczne w zwiększaniu wewnątrzkomórkowych poziomów ROS w komórkach NHBE hodowanych w interfazie powietrze-ciecz (Figura 2C) (45); efekt ten był hamowany przez inhibitory oksydazy NADPH QA i DPI. pRWEOX +, ale nie pRWEOXa, zwiększał wewnątrzkomórkowe poziomy ROS w komórkach NHBE hodowanych w interfazie powietrze-ciecz (Figura 2C). Odkrycia te wskazują, że RWE indukuje stres oksydacyjny w komórkach NHBE hodowanych w fizjologicznie istotnych warunkach. Wcześniejsze badania wykazały, że ekstrakty z pyłków i roztoczy kurzu domowego (HDM) posiadają aktywność proteazy (46). Zgodnie z poprzednią pracą, w której stwierdzono, że proteazy mogą generować wytwarzanie ROS w komórkach nabłonka dróg oddechowych (47), dodając ekstrakt HDM do hodowanych komórek A549 indukowanych ROS (Figura 2D); ta indukcja była hamowana przez koktajl inhibitorów proteazy. Przeciwnie, indukowane RWE wytwarzanie ROS nie było hamowane przez inhibitory proteazy (Figura 2D). Dane te wskazują, że aktywność oksydazy NADPH w ekstraktach pyłkowych, a nie ich aktywność proteazy, indukuje wewnątrzkomórkowe ROS w hodowanych komórkach nabłonka. Figura 2RWE zwiększa poziomy ROS w hodowanych komórkach nabłonkowych. (A) Wpływ inhibitorów oksydazy NADPH na indukowany ekstraktem pyłkowym. Wzrost poziomu ROS w komórkach A549. Wskazano obecność lub brak NADPH w mieszaninie reakcyjnej. PN, ekstrakt z drzewa pekanowego; TG, ekstrakt z trawy tymotki. P <0,001; P <0,0001. (B) Indukowanie wewnątrzkomórkowego ROS przez RWE w różnych komórkach nabłonkowych i jego hamowanie przez NAC. Pokazane są RWE (czarne słupki), RWE plus NAC (białe słupki) i X + XO (szare paski). (C) Wpływ inhibitorów oksydazy NADPH na indukowany przez RWE wzrost poziomów ROS w komórkach NHBE hodowanych w interfazie powietrze-ciecz. (D) Wpływ inhibitorów proteazy na wytwarzanie ROS indukowanych przez ekstrakty HDM i RWE w komórkach A549. Pokazane są komórki z (białe słupki) i bez (czarne słupki) inhibitory proteazy. Wewnętrzne oksydazy pyłkowe NADPH indukują stres oksydacyjny w płucach. Wcześniejsze badania wykazały, że ekspozycja na antygeny w płucach osób z alergią rekrutuje komórki zapalne, które produkują ROS (48. 50). Nierozstrzygnięte pozostaje pytanie, czy wdychanie ziaren pyłku bezpośrednio wywołuje stres oksydacyjny przed rekrutacją komórek zapalnych. Postawiliśmy hipotezę, że ekspozycja na oksydazy NADPH pyłków indukuje ROS w płucach myszy niezależnie od stanu zapalnego. Eksperymenty wykorzystujące większość modeli mysich alergicznych zapalenia dróg oddechowych wymagają powtarzających się wyzwań związanych z alergenem (51, 52). W takich modelach trudno jest rozróżnić efekty stresu oksydacyjnego generowanego bezpośrednio przez ekspozycję na alergen i ROS generowane przez rekrutowane komórki zapalne. Aby przezwyciężyć to ograniczenie i badać zdarzenia, które są specyficznie indukowane przez wewnętrzne oksydazy NADPH pyłku w ciągu minut ekspozycji, użyliśmy modelu myszy uczulonych na RWE, które wykorzystują pojedyncze prowokacje do płuc z kontrolą RWE lub PBS (9, 10, 12). Wyzwanie z RWE zwiększyło poziomy markerów stresu ROS i stresu oksydacyjnego, takich jak utleniony glutation (GSSG), aldehyd malonowy (MDA) i 4-hydroksynonen (4-HNE) w płynach z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) (Figura 3, A i B) [więcej w: badanie psychotechniczne, koszt ubezpieczenia zdrowotnego, dicortineff ulotka ] [patrz też: microgynon ulotka, dicortineff ulotka, ibum forte ulotka ] [hasła pokrewne: microgynon ulotka, dicortineff ulotka, ibum forte ulotka ]