Zwiększone wspomaganie odporności adaptacyjnej przez proapoptotycznego mutanta Mycobacterium tuberculosis ad 10

Po dwukrotnym przepłukaniu PBS, populację CFSElow pulsowano 20 .M peptydu OVA wiążącego H-2Kb (SIINFEKL) przez godzinę w 37 ° C w kompletnym RPMI, następnie przemyto intensywnie i ponownie zawieszono w PBS. 2 populacje oznaczone za pomocą CFSE zmieszano w równych proporcjach i wstrzyknięto iv (1 × 107 komórek / mysz) myszom zakażonym przez mykobakterie (odpornym) lub niezakażonym (naiwnym). Po 16 godzinach zebrano śledziony, a populację limfocytów CFSElow i CFSEhigh oznaczono ilościowo przy użyciu cytometru przepływowego FACSCalibur (BD Biosciences). Dane analizowano przy użyciu oprogramowania WinMDI (wersja 2.8; http://facs.scripps.edu/software.html), a procent lizy specyficznej dla peptydu obliczono stosując następujący wzór:% lizy = 100. 100 × [(stosunek CFSElow do CFSEhigh dla zainfekowanych myszy) / (stosunek CFSElow do CFSEhigh dla niezakażonych myszy)]. Test prezentacji antygenu in vivo. Splenocyty donorowe izolowano od myszy transgenicznych TCR z niedoborem Rag1 (Taconic / National Institute of Allergy and Infectious Diseases [NIAID]). Po lizie rbc komórki znakowano przy użyciu 20. M CFSE przez 5 minut w RT w stężeniu 5 x 107 komórek / ml w PBS plus 5% FBS. Komórki przemyto raz PBS plus 5% FBS i dwa razy PBS przed wstrzyknięciem do biorców B6.PL (Thy1.1 +) (The Jackson Laboratory). Myszy otrzymały komórki znakowane 3 x 105 lub x 107, jak wskazano przez boczną żyłę ogonową, a następnie zaszczepiono je podskórnie lub zainfekowano iv x 106 CFU pS2A2-OVA lub kontrolnymi szczepami bakteryjnymi. Splenocyty zebrano 5. 7 dni później, wybarwiono przeciwciałami anty-Thy1.2 i anty-B220 (oba z BD Biosciences) i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Ekspansję oceniano ilościowo przez bramkowanie przeniesionej populacji (Thy1.2 +) i mierzenie procentu niepodzielonych (CFSEhigh) komórek w obrębie tej populacji. Analiza populacji komórek T pamięci. Myszy C57BL / 6 zostały adoptatywnie przeniesione z 5 × 105 komórek OT-1, zakażonych podskórnie 24 godziny później × 106 CFU H37Rv-OVA lub a. SecA2-OVA i uśmiercone po 2, 4 lub 20 tygodniach. Wyizolowano splenocyty, barwiono znakowanymi PE peptydami załadowanymi peptydem (SIINFEKL) H-2Kb w połączeniu z przeciwciałami specyficznymi dla Thy1.2, CD44, CD62L i B220 (wszystkie przeciwciała zakupiono od BD Biosciences). Procentowe barwienie limfocytów za pomocą markerów tetrameru i markera ekspresyjnego zgodnego z komórkami pamięci centralnymi (CD44highCD62Lhigh) lub efektorowymi (CD44highCD62Llow) oznaczano za pomocą cytometrii przepływowej. Tetramery H-2Kb obciążone peptydem uzyskano z ośrodka rdzeniowego tetrameru w Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Szczepienia i badania prowokacyjne. Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez instytucjonalne komisje zajmujące się opieką nad zwierzętami i ich używaniem w College of Medicine Alberta Einsteina, Centrum Oceny i Badań Biologicznych oraz Colorado State University. Myszy C57BL / 6 zaszczepiono podskórnie x 106 CFU M. tuberculosis. SecA2 lub M. bovis BCG-Pasteur, jak opisano wcześniej (43). Po 2 miesiącach przeprowadzono próbę aerogeniczną, stosując komorę inhalacyjną Glas-Col, aby dostarczyć 50. 100 CFU na zwierzę szczepów M. tuberculosis Beijing / W (HN878) lub Erdman. Myszy uśmiercono po 1, 3 i 5 miesiącach po prowokacji. Płuca i śledziony poszczególnych myszy aseptycznie usunięto i homogenizowano oddzielnie w 5 ml normalnej soli fizjologicznej plus 0,05% Tween-80, stosując blender Seward Stomacher 80 (Tekmar). Homogenaty rozcieńczono seryjnie i wysiano na agarze Middlebrook 7H10 z higromycyną (50 .g / ml). Tkanki płuc poddano obróbce histopatologicznej, stosując standardowe wiązanie parafiny, cięcie i barwienie H & E. W badaniu przeżycia zwierzęta zakażone M. tuberculosis Erdman obserwowano codziennie aż do śmierci lub stania się konającym i poddano eutanazji. Nieprzyjacielskie świnki morskie Hartley (Charles River Laboratories) zaszczepiono śródskórnie x 103M. gruźlica. secA2 lub BCG-Pasteur, a następnie 6 tygodni później przez prowokację aerozolową niską dawką (10. 30 CFU) wirulentnej M. tuberculosis H37Rv przy użyciu urządzenia do wytwarzania aerozoli w komorze Madison (8). Tkanki płuc, śledziony i węzłów chłonnych zebrano i poddano obróbce do oznaczania CFU i do histopatologii po i 2 miesiącach po prowokacji, stosując sposoby podobne do opisanych powyżej dla myszy. Badane węzły chłonne były skupiskiem zlokalizowanym przy bifurkacji tchawicy, która reprezentuje węzły śródpiersia i czaszki śródpiersia. W przypadku ilościowej oceny histopatologicznej przekrojów tkanek świnki morskiej, sekcje były ślepo ułożone w porządku rangi od normalnego do najcięższego, a następnie punktowano w następujący sposób: 0 = normalny, = łagodny, 2 = umiarkowany, 3 = ciężki
[więcej w: szpital dziecięcy lublin chodźki, street workout plan treningowy, produkty o niskim indeksie glikemicznym wykaz ]
[przypisy: twardzina układowa objawy, vegantalgin, lek doreta ]
[przypisy: twardzina układowa objawy, vegantalgin, lek doreta ]