Zwiększone wspomaganie odporności adaptacyjnej przez proapoptotycznego mutanta Mycobacterium tuberculosis ad 8

Łącząc SecA2 z dodatkowymi mutacjami, które uniemożliwiają różne inne unikanie odporności oraz funkcje promujące wirulencję M. tuberculosis, możliwe jest opracowanie nowej generacji bezpiecznych i skutecznych atenuowanych szczepów szczepionki przeciwko prątkom, które będą miały większy wpływ niż BCG na obecny globalny problem TB. Metody Szczepy bakteryjne i podłoża wzrostowe. Wirulentne szczepy M. tuberculosis H37Rv (uzyskane z Trudeau Institute), Erdman, HN878 (otrzymane od C. Barry, sekcja badań gruźlicy, NIH, Bethesda, Maryland, USA) i mutant M. tuberculosis. SecA2 (mc23112) zostały opisane wcześniej (16, 44). Wirulentne szczepy, mutanty i transformanty M. tuberculosis hodowano na bulionie Middlebrook 7H9 lub agarze 7H10 zawierającym 10% (obj./obj.) Kwasu oleinowego. Albumin-dekstroza-katalaza (OADC; BD Diagnostics. Diagnostic Systems), 0,5% glicerolu, i. 0,05% (obj./obj.) Tween-80. Szczep E. coli DH5. użyto do klonowania i hodowano na agarze lub bulionie Luria-Bertani (Fisher Scientific) w 37 ° C. Ampicylina (50 .g / ml), higromycyna (50 .g / ml do selekcji prątków lub 150 .g / ml dla E. coli) i kanamycyna (20 .g / ml do selekcji prątków lub 40 .g / ml do E coli) zastosowano do selekcji rekombinowanych szczepów. Budowa rekombinowanych szczepów prątków. W celu uzupełnienia delecji secA2, pełnej długości gen M. tuberculosissecA2 zamplifikowano za pomocą PCR z genomowego DNA M. tuberculosis H37Rv przy użyciu starterów SecC5 (5a-AAGCTTGCGTGAACGTGCACGGTTGTCCACGAATTGC-3a) i SecC3 (5a-ATCGATTCAGCGGAACACCCCGGGCAGACT-3 (3)). Produkt PCR wklonowano do wektora pGEM przy użyciu zestawu do klonowania TA (Invitrogen). Fragment zawierający gen secA2 wycięto i wklonowano do pMV361, integrujący wektor M. tuberculosis z promotorem HSP60 (45). Wszystkie transformacje szczepów M. tuberculosis przeprowadzono zgodnie z opublikowanym protokołem (46). Do znakowania epitopu lipoproteiny 19 kDa stosowano przedłużone podejście starterowe. Gen lipoproteinowy 19-kD zamplifikowano z genomowego DNA M. tuberculosis H37Rv stosując starter skierowany na 5. koniec sekwencji kodującej gen lipoproteiny 19-kDa (5a-GATATCGTGAAGCGTGGACTGAC-3 .) w połączeniu z 3. starter rozszerzony tak, aby zawierał sekwencję kodującą aminokwasy 254. 269 (5a-GCTAGCATTTAAAACGAGGTCCACTCGGTCAGCTTCTCGAAGTTGATGATCGACTCCAGCTTCCTACAGGAGTCTCCTCTCTGATTTCGAACGACTTG-3.). Produkt PCR zawierający sekwencję 19-kDa OVA zligowano z pMV261, replikującym pozachromosomalnym wektorem M. tuberculosis z promotorem HSP60 (45). Uzyskany plazmid, oznaczony jako p19OVA, zastosowano do transformacji WT, zmutowanych lub skomplementowanych szczepów M. tuberculosis H37Rv. Aby wytworzyć postać białka SodA z sekwencją sygnałową rozpoznawaną przez system sekrecji SecA1, sekwencje kodujące peptyd sygnałowy antygenu 85b i cały gen sodA zostały zamplifikowane z genomowego DNA M. tuberculosis H37Rv przy użyciu par primerów 5a-GATATCATGGCCACAGACGTGAGCCGAAAGATTCGAG -3. plus 5. -GCCGGGATCCCGCGCCCGCGGTTGCCGCTCCGCC-3. i 5-GCTAGCTCAGCCGAATATCAACC-3. plus odpowiednio 5-GCTAGCTCAGCCGAATATAACC-3 .. Każdy produkt PCR był oddzielnie klonowany do wektora pGEM przy użyciu zestawu do klonowania TA (Invitrogen). W sposób etapowy fragmenty te wycięto i ligowano do pMV361, aby utworzyć pMV3a-soda. Detekcja ekspresji znacznika epitopu OVA metodą Western blot. H37Rv, H37Rv-OVA, a-secA2-OVA i a-secA2-C-OVA hodowano do połowy fazy logarytmicznej w pożywce 7H9. Po odwirowaniu peletki przemyto dwukrotnie PBS i poddano lizie buforem do ekstrakcji białka (50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 0,6% SDS, 0,06% DNazy, 0,06% RNazy, 0,07% pepstatyny, 0,05% leupeptyny i 20 mM PMSF ). Stężenie białka w każdym lizacie oznaczano za pomocą testu BCA (Pierce). Równe ilości białka (20 .g) załadowano na ścieżkę i poddano SDS-PAGE, a następnie przeniesiono na membranę PVDF. Po zablokowaniu za pomocą PBS z 5% odtłuszczonym mlekiem, błonę inkubowano z króliczym poliklonalnym przeciwciałem anty-SIINFEKL (Covance), a następnie wykrywając kozie przeciwciało anty-królicze połączone z HRP (Invitrogen). Określone prążki zostały oświetlone przy użyciu trwałego roztworu nadtlenku SuperSignal West Pico (Pierce). Badania apoptozy w BMM i komórkach THP-1. BMM otrzymano zgodnie z wcześniej opublikowanymi metodami (5). W skrócie, szpik spłukany z kości piszczelowej i kości udowej u myszy w wieku 6 do 10 tygodni C57BL / 6 lub BALB / c (The Jackson Laboratory) zebrano aseptycznie i hodowano w płytkach serologicznych 100 × 20. Mm bez hodowli tkankowej (Fisher) o gęstości 2 x 105 komórek / ml w pożywce BMM (DMEM uzupełnionej 1% HEPES, 1% l-glutaminy, 1% aminokwasów niestanowiących niezbędności, 100 U / ml penicyliny i 100 ug / ml streptomycyny [ wszystkie z Gibco BRL, Invitrogen], 10% FBS [HyClone] i 10% pożywki L929 uwarunkowanej fibroblastami) przez 6 dni
[podobne: microgynon ulotka, ibum forte ulotka, koszt ubezpieczenia zdrowotnego ]
[hasła pokrewne: microgynon ulotka, dicortineff ulotka, ibum forte ulotka ]
[przypisy: microgynon ulotka, dicortineff ulotka, ibum forte ulotka ]