Zwiększone wspomaganie odporności adaptacyjnej przez proapoptotycznego mutanta Mycobacterium tuberculosis ad 9

W dniu 6, komórki adherentne zebrano po oderwaniu przez inkubację przez 20 minut w 4 ° C z 5 mM EDTA / PBS. Komórki THP-1 (ATCC) hodowano w RPMI-1640 (Gibco BRL, Invitrogen) uzupełnionym 10% FBS, 1% HEPES, 1% aminokwasami nieistotnymi i niezbędnymi aminokwasami oraz 50 .g / ml penicyliny i streptomycyny ( kompletny RPMI). Komórki THP-1 traktowano 40 ng / ml PMA (Sigma-Aldrich) przez noc w celu indukowania ich różnicowania do komórek podobnych do makrofagów. BMM lub zróżnicowane komórki THP-1 wysiewano na 6-studzienkowe płytki przy 1×106 komórek na dołek i pozostawiano do przylgnięcia przez noc. Dla makrofagów C57BL / 6, wstępne traktowanie 25 ng / ml IFN-y (PeproTech) przez 24 godziny przed zakażeniem użyto do aktywacji komórek i zwiększenia ich wrażliwości na indukcję apoptozy. Zdyspergowane prątki inkubowano z komórkami przez 3 godziny (MOI 10). Komórki następnie przemyto dwukrotnie PBS i inkubowano przez 2. 4 dni, jak wskazano na legendach figur. Po zakażeniu BMM BALB / c utrzymywano w pożywce BMM (z 10% pożywki L929 kondycjonowanej, co było konieczne, aby zapobiec wysokim poziomom spontanicznej śmierci komórek), podczas gdy BMM C57BL / 6 utrzymywano w pożywce BMM bez pożywki kondycjonowanej L929. Obecność komórek apoptotycznych w hodowlach komórkowych analizowano za pomocą zestawu do wykrywania śmierci komórek In Situ, fluorescencji (Roche Diagnostics) i Carboxyfluorescein FLICA Apoptosis Detection Kit (Immunochemistry Technologies), zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku testów hamowania kaspazy-3, komórki THP-1 traktowano przez godzinę przed zakażeniem nieodwracalnym inhibitorem kaspazy-3 Z-DEVD-FMK (R & D Systems) w końcowym stężeniu 10 .M, następnie przemyto i zakażono prątkami jako wskazany. Test aktywności dysmutazy ponadtlenkowej. Równe liczby pałeczek H37Rv, a secA2, a secA2-C i a secA2-a sodAA najpierw zaszczepiono w 10 ml hodowli ciekłego podłoża Sauton (16), a następnie hodowano w 37 ° C przez 7 dni. Pięć mililitrów początkowej hodowli inokulowano następnie do 50 ml pożywki Sauton i hodowano przez 7 dni. Hodowle odwirowano, a supernatanty zebrano i przesączono przez filtr 0,2 .m i następnie zatężono 50-krotnie stosując filtr odśrodkowy Centriprep z limitem masy cząsteczkowej 3 kDa (Millipore). Stężenie białka oznaczano za pomocą testu BCA (Pierce). Aktywność SodA zmierzono przy użyciu zestawu do oznaczania SOD-WST (Sigma-Aldrich), który wykorzystuje rozpuszczalną w wodzie sól tetrazolową, WST-1 [2- (4-jodofenylo) -3- (4-nitrofenylo) -5- (2, 4-disulfofenylo) -2H-tetrazoliowa, sól monosodowa], która daje rozpuszczalny w wodzie barwnik formazowy po redukcji przez ponadtlenek wytworzony przez oksydazę ksantynową. Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) jest określona przez hamowanie zależnego od czasu formowania barwnika formazanu, co określa się ilościowo na podstawie absorbancji przy 405 nm. Objętość przesączu hodowlanego zawierającego 3,5 .g białka całkowitego stosowano do podwójnych oznaczeń aktywności SOD dla każdego przesączu hodowli bakteryjnej, co dało wskaźnik hamowania aktywności SOD 10%> 14% z WT H37Rv. Test ELISPOT dla IFN-y. ELISPOT został wykorzystany do wykrywania IFN-y sekrecja przez indywidualne limfocyty T CD8 + od zainfekowanych myszy po stymulacji peptydem OVA (SIINFEKL) in vitro. Płytki ELISPOT (Millipore) pokryto IFN-y wychwytuj przeciwciało (BD Biosciences) przez 16 godzin w temperaturze pokojowej (RT). Płytki przemyto i zablokowano 1% BSA przez 2 godziny w RT. Po traktowaniu buforem do lizy rbc (Sigma-Aldrich), splenocyty wysiano z peptydem OVA (5 ug / ml) i hodowano przez 36 godzin w 37 ° C. Po usunięciu komórek płytki przemyto PBS, a następnie PBS z 0,05% Tween-20 (PBST). Biotynylowane anty-IFN-y przeciwciało wykrywające (BD Biosciences) dodano przez 2 godziny w 37 ° C, a następnie przemyto PBST. Streptawidynę a fosfatazę alkaliczną (Sigma-Aldrich) dodano do płytek przez godzinę (37 ° C), a następnie przemyto i dodano substrat BCIP / NBT (Sigma-Aldrich). Po 2 godzinach inkubacji w 37 ° C reakcję zatrzymano przez dodanie wody do studzienek. Płytki utrwalano przez dodanie 4% paraformaldehydu, a plamki zliczano za pomocą czytnika ELISPOT (Autoimmun Diagnostika). W celu oceny odpowiedzi limfocytów T CD4 + zastosowano podobną procedurę, z tym wyjątkiem, że limfocyty T najpierw rozdzielono stosując zestaw do negatywnej izolacji komórek T mysich Dynal (Invitrogen) i PPD (20 (jg / ml, Instens Serum Institut) lub peptyd-25 ( 5 .g / ml, pozycja 47) M. tuberculosis Ag85B zastosowano jako antygeny przypominające. Test cytotoksyczności in vivo. Limfocyty śledzionowe izolowano od naiwnych myszy C57BL / 6, traktowano buforem do lizy rbc, ponownie zawieszano w 5 x 107 / ml w PBS z 5% FBS i znakowano przez 5 minut w RT z CFSE (Invitrogen) w stężeniu 0,5. M ( Komórki CFSElow) lub 10 .M (komórki CFSEhigh)
[podobne: tabliczka mnożenia na czas, kalafior wartości odżywcze, malowanie włosów w ciąży ]
[hasła pokrewne: szpital dziecięcy lublin chodźki, emedlink, koszulki ratownik medyczny ]
[hasła pokrewne: szpital dziecięcy lublin chodźki, emedlink, koszulki ratownik medyczny ]