Zwiększone wspomaganie odporności adaptacyjnej przez proapoptotycznego mutanta Mycobacterium tuberculosis ad

Podczas gdy delecja seA2 z M. tuberculosis nie ma wpływu na wzrost w hodowli, powoduje częściowe osłabienie wzrostu in vivo. Można to wytłumaczyć po części utratą sekrecji SodA, co powinno skutkować zmniejszeniem zdolności bakterii wewnątrzkomórkowych do detoksyfikacji anionów ponadtlenkowych wytwarzanych w komórkach gospodarza w odpowiedzi na infekcję (17). Jednak nadprodukcja anionów ponadtlenkowych jest również związana z indukcją apoptozy w różnych systemach eksperymentalnych (18), co sugeruje, że inną ważną funkcją wydzielanego mykobakteryjnego SodA może być hamowanie indukowanej infekcją apoptozy komórek gospodarza. Rzeczywiście, w porównaniu z niepatogennymi gatunkami prątków, o których wiadomo, że są proapoptotyczne, patogenne prątki, takie jak M. tuberculosis, wyrażają wyraźnie wyższe poziomy SodA (19), a antysensowne hamowanie ekspresji SodA w M. tuberculosis powoduje zmniejszenie rozwoju bakterii i wyższą poziomy apoptozy w tkankach zainfekowanych myszy (20). Aby bezpośrednio zbadać rolę secA2 w hamowaniu apoptozy, transformowane ludzkie komórki monocytów / makrofagów (komórki THP-1) lub pierwotne makrofagi pochodzące od myszy BM (BMM) (szczepy C57BL / 6 lub BALB / c) zakażono przy MOI z 10 pałeczek na makrofag z WT M. tuberculosis (szczep H37Rv), mutant H37Rv z delecją secA2 (a secA2) lub komplementowany szczep mutanta (a secA2-C). Po 72 godzinach ilościowa ocena apoptozy przez barwienie pod kątem uszkodzenia nici DNA (TUNEL) i aktywacji polikaspazą wykazała, że. SecA2 silnie indukowało oba te markery apoptozy zarówno u ludzkich i mysich makrofagów, podczas gdy WT M. tuberculosis nie (Fig. A i B oraz Dodatkowa ryc. 1, materiał uzupełniający dostępny online w tym artykule: doi: 10.1172 / JCI31947DS1). Wzmocnione barwienie TUNEL całkowicie odwrócono za pomocą a-secA2-C, który zachowywał się identycznie jak szczep WT (Figura 1, A i B). Fig. Wykazanie kaspazy i zależnej od SodA apoptozy w makrofagach przez zakażenie M. tuberculosis. SecA2. (A) Ludzkie komórki THP-1 infekowano M. tuberculosis (H37Rv), a secA2 i komplementarnymi pSaA2 (a secA2-C) szczepami przy MOI wynoszącym 10. Komórki zabarwiono po 48 i 72 godzinach dla TUNEL lub dla aktywacja kaspazy przy użyciu sond FLICA i analizowana przez FACS. Przedstawiono reprezentatywne histogramy barwienia za pomocą TUNEL lub sondy swoistej dla polikaspazy (fluoresceina-VAD-FMK) po 48 godzinach (otwarty histogram, niezainfekowany, wypełniony histogram, zakażony H37Rv lub a secA2 jak wskazano). Oznaczono ilościowo przez FACS komórek dodatnich dla TUNEL lub dla aktywnej kaspazy-8, kaspazy-9 lub polikaspazy. Przedstawione dane pochodzą z punktów czasowych wykrycia sygnału szczytowego (48 godzin dla TUNEL i polikaspazy, 72 godziny dla kaspazy-8 i 9). (B) Barwienie TUNEL mysich BMM 72 godziny po zakażeniu wskazanymi szczepami bakteryjnymi. Barwienie oznaczono ilościowo metodą FACS, tak jak w A. (C) barwienie TUNEL komórek THP-1 zakażonych wskazanymi bakteriami przez 48 godzin pod nieobecność lub z obecnością specyficznego inhibitora kaspazy-3 (Z-DEVD-FMK). * P <0,001 w porównaniu do braku inhibitora (jednoczynnikowa ANOVA, post-test Bonferroniego). (D) Przesiany z hodowli mutantów H37Rv,. SecA2 lub. SecA2-. SodAA analizowano pod kątem aktywności SodA (po lewej). Wykres pokazuje średnią i zakres dla duplikatów próbek, z aktywnością SodA znormalizowaną do poziomu WT (H37Rv). . Poniżej poziomu wykrywania. A secA2-a sodA wykazał przywrócenie aktywności SodA w przesączu hodowlanym, a także odwrócił śmierć komórek TUNEL + indukowaną przez pashA2 w komórkach THP-1 zakażonych przez 48 godzin przy MOI 10: (po prawej). Wiadomo, że kaspazy są aktywowane przez infekcję wirulentnymi, jak również niezawirusowymi szczepami M. tuberculosis (10, 21), chociaż w pewnych warunkach indukcja śmierci makrofagów przez M. tuberculosis zachodzi w sposób niezależny od kaspaz ( 22). Zaangażowanie kaspaz w apoptozę indukowaną przez a. SecA2M. gruźlica była oceniana przez pomiar całkowitej aktywności kaspazy i aktywności kaspaz 8 i 9 w 48 i 72 godzin po zakażeniu w komórkach THP-1 (Figura 1A i dane nie pokazane). Kaspazy 8 i 9 wybrano, ponieważ wiadomo, że są inicjatorami odpowiednio szlaków śmierci komórkowej (zależnych od receptorów) i wewnętrznych (mitochondrialnych) (23). [patrz też: street workout plan treningowy, kalafior wartości odżywcze, rehabilitacja po zerwaniu ścięgna achillesa ] [więcej w: emedlink, koszulki ratownik medyczny, twardzina układowa objawy ] [więcej w: emedlink, koszulki ratownik medyczny, twardzina układowa objawy ]